ICS 67.100.01 X16 DB37 山东省地方标准 DB37/T3531—2019 羊奶中羊、大豆源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法 发布：2019-03-21 实施：2019-04-21 山东省市场监督管理局 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009规则起草，由山东省畜牧兽医局提出并监督实施，归口于山东省畜牧专业标准化技术委员会。起草单位为山东省农业科学院生物技术研究中心。主要起草人包括张全芳、范阳阳、刘艳艳、胡悦、陈雪燕、刘国霞、陈淑娟、谷玉霞、王俊燕、步迅。 1 范围 本标准规定了羊奶产品中羊、大豆源性成分的实时荧光定性PCR检测方法。适用于生鲜羊奶、灭菌液态羊奶、羊奶粉等羊奶制品。方法的检出限为0.1%。 2 规范性引用文件 下列文件对于本标准的应用是必不可少的。注日期的引用文件，仅所注日期版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（含所有修改单）适用于本标准。 - GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 - GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 3.1 羊源性：指山羊和绵羊的成分。 3.2 实时荧光PCR (real-time fluorescence PCR)：在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号积累实时监控整个PCR进程，对未知模板进行定性或定量分析。 3.3 Ct值 (cycle threshold)：循环阈值，用于判定PCR反应结果。 4 原理 以山羊和绵羊线粒体16SrDNA及大豆内源基因Lectin为靶基因，在不同物种间保守区设计通用引物，可变区设计物种特异性探针，采用TaqMan实时荧光PCR技术扩增，通过PCR扩增反应的荧光信号及循环阈值判定羊和大豆的源性成分。 5 试剂和材料 除非另有说明，分析中使用分析纯试剂及符合GB/T 6682规定的一级水。 5.1 试剂 5.1.1 氯化钠 (NaCl) 5.1.2 浓盐酸 (HCl) 5.1.3 三羟甲基氨基甲烷 (Tris base) 5.1.4 二水乙二胺四乙酸二钠 (NaEDTA·2H2O) 5.1.5 十二烷基硫酸钠 (SDS) 5.1.6 磷酸盐缓冲液 (PBS) 5.1.7 异硫氰酸胍 (GuSCN) 5.1.8 硅珠 (silica) 5.1.9 蛋白酶冻干品 5.1.10 聚乙二醇辛基苯基醚 (Triton X-100) 5.1.11 无水乙醇 5.1.12 Chelex-100树脂 5.2 材料 5.2.1 生理盐水：称取0.85g氯化钠加入20mL水溶解，转入100mL容量瓶，加水定容，121℃灭菌20min，室温降温后4℃保存。 5.2.2 20mg/mL蛋白酶K溶液：称取0.2g蛋白酶冻干品，转入10mL容量瓶，加水定容，分装后-20℃保存。 5.2.3 5% Chelex-100：称取5g Chelex-100树脂，转入100mL容量瓶，加水定容。 5.2.4 1 mol/L Tris-HCl (pH6.4) 溶液：称取12.1g三羟甲基氨基甲烷于100mL烧杯，加入80mL水，用浓盐酸调pH至6.4，转入100mL容量瓶，加水定容，121℃灭菌20min，室温保存。 5.2.5 0.5 mol/L EDTA (pH8.0) 溶液：称取18.61g Na2EDTA·2H2O置于100mL烧杯，加水定容并调pH至8.0。