ICS 11.220
B41
备案号：49688-2016
辽宁省地方标准

DB21/T2592.3-2016
鸡传染性疾病检测方法 第3部分：鸡马立克氏病毒实时荧光PCR检测方法
Detection method of chicken infectious disease Part 3: The testing method of real-time fluorescent PCR for chicken Marek's disease

2016-03-18 发布
2016-05-18 实施
辽宁省质量技术监督局 发布

前言
本标准《鸡传染性疾病检测方法》按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草，分为三个部分：
— 鸡传染性法氏囊病毒实时荧光RT-PCR检测方法；
— 鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR检测方法；
— 鸡马立克氏病毒实时荧光PCR检测方法。
本部分为第3部分，由辽宁省动物疫病预防控制中心提出，由辽宁省畜牧兽医局归口。
起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。
主要起草人包括王黑、曹东、闫海滨、石霖、赵培、何欣、蔡树山、齐德林、李井春、马建山、姚伟、孙洪志。

1 范围
本标准规定了鸡马立克氏病毒（Marek's disease virus，MDV）实时荧光PCR检测方法的实验技术要求。
本标准适用于鸡马立克氏病毒的检测和鉴定。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的：
中华人民共和国农业部公告第302号《兽医实验室生物安全技术管理规范》。

3 缩略语
MDV：鸡马立克氏病毒（Marek's disease virus）
Ct值：循环阈值（cycle threshold）
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）
PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）
PBS：磷酸盐缓冲生理盐水（phosphate buffered saline）

4 仪器与器材
4.1 仪器
分析天平；高速离心机；荧光PCR扩增仪；冰箱（4℃、-20℃、-70℃）；水浴锅；微量移液器（2μL、20μL、200μL、1000μL）。

4.2 器材
组织匀浆器或研钵；眼科剪；眼科镊；刀片；1.5mL灭菌离心管；PCR八联排管或96孔板；吸头（10μL、200μL、1000μL）；灭菌双蒸水；称量纸。

5 试剂和材料
DNAzol Reagent：DNA抽提试剂，4℃～8℃保存。
SYBR Green I试剂盒：-20℃保存，解冻后4℃～8℃保存不超过1个月。
PBS（0.02 mol/L，pH 7.2）。
无水乙醇：-20℃预冷。
75%乙醇：-20℃预冷。
阴性对照：灭菌双蒸水。
阳性对照：MDV细胞培养物。

6 操作步骤
6.1 样品的采集、存放和运输
采样工具应严格灭菌处理。组织样品采集应使用无菌器械操作。

6.2 DNA提取与PCR检测
包括DNA提取、扩增体系配制及荧光PCR扩增检测等步骤。

7 结果判定
7.1 阈值设定
7.2 质控标准
7.3 结果描述及判定

附录A（规范性附录）
PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）配方