DB51/T1082—2010《四川省地方标准 饲料中伏马毒素B的测定 高效液相色谱法》 前言 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口，四川省质量技术监督局批准，四川省饲料工作总站起草。主要起草人：柏凡、李云、魏敏、王宇萍、赵立军、张静。本标准的附录A为资料性附录。 1 范围 本标准规定了饲料中伏马毒素B的含量测定方法，采用高效液相色谱法(HPLC)。适用于配合饲料、浓缩饲料及饲料原料的检测。本标准中伏马毒素B的检出限为0.2 mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对本标准的应用必不可少。注日期的引用文件，仅所注日期版本适用；不注日期的引用文件，其最新版本适用。 - GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 - GB/T14699.1 饲料采样 - GB/T20195 动物饲料试样的制备 3 原理 试样经甲醇-水提取，离心、过滤后，滤液通过免疫亲和柱净化，再经衍生化处理，用高效液相色谱仪荧光检测器测定，采用外标法计算伏马毒素B1含量。 4 试剂和溶液 除特殊说明外，所有试剂均为分析纯，色谱用水符合GB/T6682一级用水标准。 4.1 甲醇：色谱纯 4.2 乙腈：色谱纯 4.3 乙酸：优级纯 4.4 磷酸、盐酸、氯化钠、氯化钾、磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、四硼酸钠、巯基乙醇、邻苯二甲醛：优级纯 4.5 提取液：甲醇与水按体积比80:20混合 4.6 衍生剂：5 mg邻苯二甲醛溶于1 mL甲醇，用0.05 mol/L四硼酸钠溶液定容至50 mL，加入25 μL巯基乙醇，混匀备用（4℃可保存一周） 4.7 磷酸盐缓冲液(PBS)：称取8.0 g氯化钠、1.44 g磷酸氢二钠、0.2 g磷酸二氢钾、0.2 g氯化钾，溶于1000 mL水，用盐酸或氢氧化钠调pH至7.0 4.8 伏马毒素B标准品：含量大于98% 4.8.1 标准贮备液：精密称取10 mg伏马毒素B1标准品，用乙腈:水(1:1)溶解，定容至100 mL，浓度100 μg/mL，2~8℃保存6个月 4.8.2 标准工作溶液：由贮备液配制成0.2 μg/mL, 1.0 μg/mL, 5.0 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL，2~8℃保存6个月 注1：接触伏马毒素B的容器需浸入4%次氯酸钠溶液半天后清洗备用 注2：操作时佩戴医用乳胶手套，并在通风橱内操作 4.8.3 伏马毒素免疫亲和柱 5 仪器与设备 5.1 分析天平：感量0.1 mg 5.2 超声波清洗器 5.3 离心机：转速≥5000 r/min 5.4 超纯水处理器 5.5 涡旋混合器 5.6 高效液相色谱仪：配备荧光检测器 5.7 氮吹仪 5.8 0.45 μm滤膜 6 试样制备 按GB/T14699.1采样，按GB/T20195选取实验室代表样品1 kg，四分法缩减至约200 g，粉碎过1 mm孔筛，混匀装入磨口瓶备用。 7 分析步骤 7.1 试样溶液制备 7.1.1 提取：称取20 g试样，加入2 g氯化钠和50 mL提取液，超声提取20 min，离心，取上清液过滤，准确量取5.0 mL滤液，加入20 mL PBS稀释，混匀待净化 7.1.2 净化：免疫亲和柱底帽去除，剪去盖帽，与10 mL注射器连接。缓冲液排出后，精确吸取上述稀释液5.0 mL过柱（流速1-2滴/秒），依次用5 mL PBS冲洗柱子，抽干后用2.0 mL甲醇洗脱，收集洗脱液