ICS 65.020.30
B 41
DB65
新疆维吾尔自治区地方标准
DB65/T 3554—2013
动物尿液中沙丁胺醇的测定 酶联免疫吸附法
Determination of salbutamol in animal urine—ELISA

2013-10-30 发布
新疆维吾尔自治区质量技术监督局
2013-12-01 实施

前言
本标准由新疆维吾尔自治区质量技术监督局提出。
本标准由新疆维吾尔自治区畜牧厅归口。
本标准由乌鲁木齐市农产品质量安全检测中心起草。
本标准主要起草人：俞晓、刘淑华、高志坚、周玉玲、唐亦兵、李瑜。

1 范围
本标准规定了动物尿液中沙丁胺醇的检测方法。
本标准适用于动物尿液中沙丁胺醇残留量的测定。
本标准适用于北京望尔和北京勤邦生物技术有限公司生产的酶联免疫试剂盒。
本标准的检测限为0.3 μg/L，方法回收率为80±10%。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

3 原理
本方法采用间接竞争ELISA，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的沙丁胺醇和微孔条上预包被偶联抗原竞争沙丁胺醇抗体，加入酶标二抗后，用底物显色，样本吸光度值与其所含沙丁胺醇含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释数，即可得出样品中沙丁胺醇的残留量。

4 测定方法
4.1 仪器和设备
4.1.1 微孔板酶标仪（450nm/630nm）。
4.1.2 洗板机。
4.1.3 涡旋仪。
4.1.4 离心机 3000 r/min以上，冷冻离心机。
4.1.5 恒温孵育箱。
4.1.6 冰箱。
4.1.7 聚乙烯离心管：2 mL、50 mL。
4.1.8 移液器。

4.2 试剂
4.2.1 去离子水，符合GB/T 6682二级水的要求。
4.2.2 酶联免疫试剂盒。
4.2.2.1 包被有沙丁胺醇的偶联抗原酶标板1块。
4.2.2.2 至少有5个浓度的标准溶液，外加一个空白溶液。
4.2.2.3 高浓度标准品（1 mL/瓶）。
4.2.2.4 酶标二抗浓缩液。
4.2.2.5 抗体工作液。
4.2.2.6 底物A液。
4.2.2.7 底物B液。
4.2.2.8 终止液。
4.2.2.9 20倍浓缩洗涤液。
4.2.2.10 样本稀释液。

5 溶液配制
洗涤工作液：用去离子水将20倍浓缩洗涤液按1:19体积比进行稀释（1份20倍浓缩洗涤液+19份去离子水），用于酶标板的洗涤。

6 测定
6.1 如尿样浑浊，需过滤或3000转以上、冷冻离心机离心10 min至清亮，取50 μL清亮尿样直接测定。
6.2 将所需数量的孔条插入微孔架，标准品和样品做两组平行实验，记录下标准品和样品孔所在的位置。
6.3 加标准品和样本各50 μL于对应的微孔中。
6.4 将抗体工作液和酶标二抗浓缩液按10:1体积比混合。
6.5 加抗体工作液和酶标二抗浓缩液的混合液（6.4）每孔50 μL，轻轻振荡混匀，用封板膜封板，置于25 ℃恒温孵育箱中避光反应30 min。
6.6 小心揭开封板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液每孔250 μL充分洗涤4～5次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干（未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。
6.7 加入底物A液每孔50 μL，再加底物B液每孔50 μL，轻轻振荡混匀，用封板膜封板，置于25 ℃恒温孵育箱中避光显色15 min。
6.8 加入终止液每孔50 μL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处（建议用双波长450/630 nm检测），在5 min内读完数据，测定每孔吸光度值。

7 判定结果
7.1 定量分析
7.1.1 对吸光度值的计算
标准溶液或样本的相对吸光度值等于标准溶液或样本的吸光度值的平均值（双孔）除以空白（浓度为0的标准溶液）的吸光度值，再乘以100%，如下式（1）：
相对吸光度值（%）= (B / B₀) × 100%
式中：
B——标准溶液或样本溶液的平均吸光度值；
B₀——空白（浓度为0的标准溶液）的平均吸光度值。
7.1.2 标准线的绘制与计算
以标准品相对吸光度值为纵坐标，以沙丁胺醇标准品浓度（μg/L）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的相对吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上查出样本所对应的浓度。本方法筛选结果为阳性的样品，需要用确证方法确证。

7.2 检测方法灵敏度
试剂盒灵敏度：0.3 μg/L。

8 注意事项
8.1 测定前须知
8.1.1 使用之前将所有试剂利用板条放置半小时以上，使温度回升至室温，注意所有试剂使用前均须摇匀。
8.1.2 使用之后立即将所有试剂放回2 ℃～8 ℃保存。
8.1.3 在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
8.1.4 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用封板膜封住微孔板。
8.1.5 取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入封袋，保存于2 ℃～8 ℃。

8.2 试剂盒使用注意事项
8.2.1 室温低于20 ℃或试剂及样本没有回到室温，会导致所有标准的吸光度值偏低。
8.2.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。洗板拍干后应立即进行下一步操作。
8.2.3 反应终止液为2 mol/L的硫酸，避免接触皮肤。
8.2.4 不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会导致灵敏度的降低；不要交换使用不同厂家和不同批号试剂盒中的试剂。
8.2.5 储存条件
保存试剂盒于2 ℃～8 ℃，不要冷冻，将不用的微孔板放入自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，要避免直接暴露在光线下。
8.2.6 空白（浓度为0的标准溶液）的吸光度（450/630 nm）值小于0.5（A450 < 0.5）时，表示试剂可能变质。
8.2.7 在加入底物A液和底物B液后，一般显色15 min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20 min（或更长），但不得超过30 min。反之，则缩短反应时间。
8.2.8 试剂盒最佳反应温度为25 ℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。