ICS 11.220
CCS B 41
DB37
山东省地方标准
DB37/T 4459—2021

鹅星状病毒感染诊断技术规范
Diagnostic technical specification for goose astrovirus infection

2021-12-27 发布
2022-01-27 实施
山东省市场监督管理局 发布


前言

本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。

本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。


1 范围

本文件规定了鹅星状病毒感染的临床诊断和实验室诊断的技术规范。其中临床诊断包括流行病学、临床症状、病理变化；实验室诊断包括样品的采集与保存、病毒分离鉴定、反转录一聚合酶链式反应（RT-PCR）、实时荧光定量RT-PCR与间接酶联免疫吸附试验（ELISA）。

本文件适用于鹅星状病毒感染的诊断、检测、监测和流行病学调查。

鹅星状病毒感染的流行病学、临床症状、病理变化适用于鹅星状病毒的初步诊断；病毒分离、RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法适用于鹅组织、分泌物、排泄物和病毒培养物中鹅星状病毒分离鉴定及核酸检测；间接ELISA抗体检测方法适用于鹅星状病毒感染的抗体特异性血清学诊断。


2 规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB 19489—2008 实验室生物安全通用要求
GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫
NY/T 541-2016 动物检疫诊断样品采集、保存与运输技术规范


3 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1
鹅星状病毒感染 goose astrovirus infection
由鹅星状病毒引起的5日龄～25日龄维鹅内脏器官与关节发生严重尿酸盐沉积的疾病。


4 实验室要求

4.1 环境
4.1.1 实验室符合GB 19489—2008和GB/T 27401要求。
4.1.2 从事RT-PCR工作的实验室应进行分区，根据条件划分出前处理区、核酸提取区、核酸扩增区、电泳检测区，形成有效的物理隔离，且为单一流向，不得倒流。特别注意电泳后的琼脂凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染。
4.1.3 生物样品应严格控制避免对环境造成污染，试验结束后应将相关样品（如血样）进行无害化处理。

4.2 人员
操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理、血清学和分子生物学实验室检测技术培训。熟悉临床诊断、病理组织学诊断、生物样品处理、病毒分离，以及核酸提取、基因扩增等分子生物学技术，熟悉RT-PCR、qRT-PCR与间接ELISA检测结果的判断方法。


5 样品

5.1 仪器设备
5.1.1 生物安全柜。
5.1.2 解剖剪。
5.1.3 解剖盘。
5.1.4 镊子。
5.1.5 组织匀浆器。

5.2 试剂与材料
5.2.1 磷酸盐缓冲液（PBS），见附录A。
5.2.2 青霉素（100000 IU/mL）。
5.2.3 链霉素（100 mg/mL）。
5.2.4 离心管。
5.2.5 样品保存管。
5.2.6 滤器（孔径0.22 μm）。

5.3 样品采集与运送
5.3.1 总则：样品采集、保存、运输应按照NY/T 541-2016技术规范进行。采样和样品前处理过程中应戴一次性手套、口罩、帽子，采样过程中样品不得交叉污染。
5.3.2 组织样品：采集疑似鹅星状病毒感染死亡鹅的肝脏、脾脏和肾脏等组织样品。采集病料时，用无菌手术剪取组织样品，置于样品保存管中，密封、编号。
5.3.3 泄殖腔/喉拭子样品：采集活禽泄殖腔/喉拭子样品，置于样品保存管中。
5.3.4 血清样品：用无菌注射器采血1 mL，将其注入1.5 mL无菌Eppendorf管中，于37℃静置2 h。分离的血清转入新的无菌Eppendorf管中，加盖，编号，待检。采集的血清样品应无溶血，置于离心管中。
5.3.5 鹅胚尿囊液：将鹅胚尿囊液加入无菌Eppendorf离心管中，加盖，编号，待检。
5.3.6 所有样品应置于密闭容器中冷藏运输，保存温度在-15℃以下，时间不超过24 h。

5.4 样品处理与保存
5.4.1 样品应在生物安全柜中进行处理，取10 g～20 g样品放入灭菌的研钵中磨碎。研磨充分的组织置于含青霉素（2000 IU/mL）、链霉素（2 mg/mL）、庆大霉素（50 μg/mL）和制霉菌素（1000 IU/mL）的pH值7.0～7.4的等渗磷酸盐缓冲液（PBS，见附录A）中，配制成10%～20%（g/mL）的悬液。样品经10000 r/min离心30 min，取上清液经0.22 μm滤器过滤除菌后，作为接种和检测材料。
5.4.2 泄殖腔/咽喉拭子置于含青霉素（2000 IU/mL）、链霉素（2 mg/mL）、庆大霉素（50 μg/mL）和制霉菌素（1000 IU/mL）的pH值7.0～7.4的PBS中。样品剧烈震荡后，10000 r/min离心10 min取上清作为检测材料。
5.4.3 鹅胚尿囊液在4℃下经10000 r/min离心10 min，将上清液转入无菌Eppendorf管中，加盖，编号，待检。
5.4.4 所有样品保存温度在-15℃以下，不超过2 wk；-70℃保存不超过30 d。

5.5 检测要求
在每次检测过程中，需要设置相应的阳性对照和阴性对照。


6 临床诊断

6.1 流行病学
鹅群发病日龄集中于5日龄～20日龄，5日龄左右开始发病，死亡率逐渐升高，10日龄～15日龄为死亡高峰，鹅群的死亡率为20%～30%，最高可达50%。

6.2 临床症状
患病维鹅表现为精神沉郁、卧地倦怠、采食减少、排白色稀便。

6.3 剖检变化与组织学变化
死亡维鹅剖检变化主要表现为内脏器官和关节腔有大量尿酸盐沉积，包括心脏、肝脏、肾脏及输尿管等，有的病例表现为肾脏出血肿大。
患鹅组织学变化主要表现为肾小管上皮细胞坏死、间质出血，肾小球肿胀，脾脏有大量红细胞浸润，肝细胞空泡变性、尿酸盐沉积。

6.4 临床诊断结果判定
同时符合6.1、6.2、6.3，则判断为疑似鹅星状病毒感染。


7 病毒分离鉴定

7.1 病毒分离
7.1.1 仪器设备与材料
7.1.1.1 不同温度的冰箱（2℃~8℃、-20℃、-70℃）。
7.1.1.2 37℃恒温孵化箱。
7.1.1.3 4℃离心机。
7.1.1.4 打孔器。
7.1.1.5 1 mL注射器。
7.1.1.6 石蜡。
7.1.1.7 照蛋器。
7.1.1.8 13日龄鹅星状病毒血清抗体阴性鹅胚。

7.1.2 样品接种和培养
将处理后的样品上清，经绒毛尿囊腔途径无菌接种13日龄鹅胚，0.2 mL/枚，37℃孵育，连续观察6 d。

7.1.2.1 弃去24 h内死亡鹅胚。
7.1.2.2 24 h～144 h内死亡和存活鹅胚置于4℃冰箱过夜或-20℃冷冻1 h，分别无菌收集尿囊液并进行无菌检查，无菌尿囊液盲传三代。

7.1.3 病毒分离结果判定