ICS 65.020.20 DB11/T507-2007 玉米品种纯度及真实性SSR分子检测方法 SSR-based Method to Assay Purity and Genuineness in Zea mays L 2007-11-22发布 2008-02-01实施 北京市质量技术监督局发布 前言 本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录，由北京市农业局提出，并由北京市农业标准化技术委员会种植业分会归口。本标准起草单位为北京市种子管理站、北京市农林科学院玉米研究中心及全国农业技术推广服务中心，主要起草人包括贾希海、郭景伦、辛景树、律宝春、田雷、吴明生、赵久然、王凤格、云晓敏、郭慧杰。 1 范围 本标准依据SSR分子标记原理，规定了玉米单交种和亲本自交系的品种纯度及真实性检测方法，包括仪器设备、试剂、引物筛选、试验步骤、纯度检测及真实性鉴定。本标准适用于玉米单交种及亲本自交系的纯度及真实性检测。 2 术语和定义 2.1 品种纯度 (varietal purity) 品种在DNA分子标记带型方面典型一致的程度，用供检样品中本品种的种子数占样品种子总数的百分率表示。 2.2 品种真实性 (varietal genuineness) 供检品种与标准品种的符合程度。 2.3 SSR分子标记 (simple sequence repeat marker) 由寡核苷酸为单位的简单串联重复序列。 2.4 引物 (primer) 结合在模板DNA上的互补短链，提供3'-OH末端作为DNA合成的起点，延伸合成模板DNA的互补链。 3 原理 玉米基因组中普遍存在由寡核苷酸为基本单位的SSR序列，品种间重复次数不同而存在多态性，可通过适宜引物进行PCR扩增，检测特定SSR位点的多态性，从而鉴别品种的纯度及真实性。 4 仪器设备及试剂 4.1 仪器设备：PCR扩增仪、DNA序列分析电泳槽、高压电泳仪（3000V，400mA，400W）、电子天平（感量0.01g-0.001g）、冰箱、微量加样器（0.5µL-1000µL）、磁力搅拌器、胶片观察灯、水平摇床、高压灭菌锅、酸度计、烧杯、镊子、刻刀、量筒、容量瓶（500mL、1000mL）、离心管（0.5mL、1.5mL）、吸头（10µL、200µL、1000µL）、注射器（100mL）、96孔深孔板、96孔PCR板、封板膜、一次性手套、离心管架、染色盒、水平仪、夹子等。 4.2 试剂：EDTA-Na2、Tris、盐酸(HCl,36%)、NaOH、10倍PCR缓冲液（不含Mg，-20℃保存）、MgCl2、四种dNTPs（-20℃保存）、Taq DNA聚合酶（5U/µL，-20℃保存）、SSR引物（-20℃保存）、矿物油、去离子甲酰胺、溴酚蓝、二甲苯青、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、硼酸、尿素、亲和硅烷、剥离硅烷、无水乙醇、四甲基乙二胺、过硫酸铵、冰醋酸、硝酸银、甲醛溶液等。DNA提取试剂、PCR反应试剂、电泳试剂和银染试剂的成分及配制按附录A执行。 5 引物筛选 适宜引物筛选原则为：扩增后的杂交种SSR电泳谱带含有双亲谱带，带型清晰且重复性好。可使用公开发表的引物或自行筛选引物。自行筛选时，取测试杂交种种子10粒及父母本种子各5粒，利用一系列引物进行分析，确定适宜引物。常见SSR引物及序列见附录B。 6 方法步骤 6.1 DNA提取：剥取种胚置入96孔深孔板中，每孔加入150µL DNA提取液，盖封板膜，煮沸5min后每孔加入150µL TE缓冲液，形成样品DNA溶液。样品DNA可直接用于PCR扩增或冷冻长期保存。 6.2 扩增：在96孔PCR反应板中，每孔依次加入13.5µL超纯水、2µL 10倍PCR缓冲液、2.5µL MgCl2(25 mmol/L)、1.2µL dNTP(2.5 mmol/L)、0.25µL SSR引物(20µmol/L)、0.25µL Taq DNA聚合酶(5U/µL)，混匀。每孔再加入2µL样品DNA和1滴矿物油，盖封板膜后放入PCR仪，扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s；60℃退火35s；72℃延伸40s，循环30-35次，最终72℃延伸5min。