DB42/T1582—2020 饲料中牛、羊源性成分定性PCR检测方法
Detection of bovine, ovine, caprine derived materials in feedstuffs by qualitative polymerase chain reaction (PCR) method

发布日期：2020-07-07
实施日期：2020-11-07
发布机构：湖北省市场监督管理局

【前言】
本文件按照 GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
本文件由华中农业大学提出。
本文件由湖北省农业农村厅归口。
本文件起草单位：华中农业大学、湖北省畜禽产品质量监督检验测试中心。
本文件主要起草人：刘榜，王文君，刘祖红，金秀娥，付明，周翔，梁昱，王峻。
本文件实施中的疑问可咨询湖北省农业农村厅（电话：027-87665821，邮箱：hbsnab@126.com）或华中农业大学（电话：027-87382290，邮箱：1iubang@mail.hzau.edu.cn）。对本文件的有关修改意见及建议请联系华中农业大学（电话：027-87282038，邮箱：xys@mail.hzau.edu.cn）。

1 范围
本文件规定了饲料中除乳制品以外的牛（普通牛、瘤牛、牦牛和水牛）、羊（绵羊和山羊）源性成分的定性PCR检测方法。本文件适用于饲料中除乳制品以外的牛（普通牛、瘤牛、牦牛和水牛）、羊（绵羊和山羊）源性成分的定性PCR检测。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14699.1 饲料采样
GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求
GB/T 27403-2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测

3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。

4 原理
根据牛、羊特异性序列，设计一对特异性引物，对待检样品提取的DNA进行PCR扩增，依据扩增特异性片段的结果，判断待检样品中是否含有牛、羊源性成分，并可根据片段大小差异进而判断是牛源性成分还是羊源性成分。

5 试剂和材料
5.1 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。
5.2 琼脂糖。
5.3 GelRed核酸染料。注：根据需要可选择其他效果相当的核酸染料作为核酸电泳的染色剂。
5.4 10 mol/L 氢氧化钠溶液：在 160 mL 水中加入 80.0 g 氢氧化钠 (NaOH)，溶解后冷却至室温，再加水定容至 200 mL。
5.5 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液 (pH 8.0)：称取 18.6 g 乙二铵四乙酸二钠 (EDTA-Na2)，加入 70 mL 水中，再加入适量氢氧化钠溶液 (5.4)，加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液 (5.4) 调 pH 至 8.0，加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa (121℃) 条件下灭菌 20 min。
5.6 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液 (pH 8.0)：称取 121.1 g 三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 溶解于 800 mL 水中，用盐酸 (HCl) 调 pH 至 8.0，加水定容至 1000 mL。在 103.4 kPa (121℃) 条件下灭菌 20 min。
5.7 5 mol/L 氯化钠溶液：称取 29.22 g 氯化钠 (NaCl) 溶于 80 mL 水中，加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa 蒸汽压 (121℃) 条件下灭菌 20 min。
5.8 10% 十二烷基磺酸钠溶液：称取 10 g 十二烷基磺酸钠 (SDS)，加入 80 mL 水中，加热至完全溶解后，冷却至室温，加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa 蒸汽压 (121℃) 条件下灭菌 20 min。
5.9 DNA 提取细胞裂解液：量取 200 mL 乙二铵四乙酸二钠溶液 (5.5)，200 mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液 (5.6)，40 mL 氯化钠溶液 (5.7)，200 mL 十二烷基磺酸钠溶液 (5.8)，混合后用水定容至 1000 mL，室温保存，备用。
5.10 20 mg/mL 蛋白酶 K 溶液：将 200 mg 蛋白酶 K (Proteinase K) 溶于 9.5 mL 水中，轻摇至完全溶解后，加水定容至 10 mL。于 -20℃ 保存备用。
5.11 硼酸。
5.12 Tris-饱和苯酚。
5.13 氯仿：异戊醇 (24:1)：将氯仿和异戊醇按照 24:1 的比例配制。
5.14 无水乙醇。
5.15 75% 乙醇。
5.16 TE 缓冲液 (pH 8.0)：分别量取 10 mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液 (5.6) 和 2 mL 乙二铵四乙酸二钠溶液 (5.5) 溶液，加水定容至 1000 mL。在 103.4 kPa (121℃) 条件下灭菌 20 min。
5.17 5×TBE 缓冲液：称取 54 g 三羟甲基氨基甲烷 (Tris)，加入 27.5 g 硼酸，先用 500 mL 水加热搅拌溶解后，加入 20 mL 乙二铵四乙酸二钠溶液 (5.5)，用 5 mol/L 氢氧化钠溶液 (5.4) 调 pH 至 8.0，然后加水定容到 1000 mL。使用时用水稀释成 0.5×TBE。
5.18 Taq 酶。
5.19 10×PCR 缓冲液。
5.20 dNTP 混合液。
5.21 6X DNA 上样缓冲液。
5.22 DNA 分子量标记：可清楚地区分 0 bp~1000 bp 的 DNA 片段。
5.23 物种特异性引物（见表1）。
5.24 引物溶液：用 TE 缓冲液 (5.16) 或水分别将引物稀释到 10 μmol/L。
5.25 PCR 产物回收试剂盒。

表1 引物信息
引物名称：牛源性引物
上游引物：5'-ATGGCTTAGGACCCAGCTCT-3'
下游引物：5'-ACARCCAGAACCTGGATCGGA-3'
片段大小：125, 107 bp
注：R=A/G，简并碱基。