ICS65.120 B46 DB41 河南省地方标准 DB41/T1587—2018 饲料中大肠杆菌O157的检测 EMA-PCR法 2018-04-17发布 河南省质量技术监督局发布 2018-07-17实施 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由河南省畜牧局提出并归口。 本标准起草单位：河南省兽药饲料监察所、郑州大学。 本标准主要起草人：方忠意、高延玲、李金磊、赵全成、陈小鸽、孟伟、魏法山。 本标准参加起草人：董鹏、狄元冉、陈蔷、张艳娜、赵林萍、曾萍、张宁、王庆东、郑彬、李博、彭丽、张磊。 1 范围 本标准规定了饲料中大肠杆菌O157的EMA-PCR检测方法。 本标准适用于饲料中大肠杆菌O157的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 GB 4789.6 食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料采样 3 原理 叠氮溴化乙锭（EMA）能够透过死细菌的细胞膜，在强光照射下与其DNA发生不可逆结合，使死细菌DNA不能作为PCR扩增模板，而活菌DNA可正常进行PCR扩增，从而实现活菌检测。 4 试剂和材料 4.1 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，试验用水符合GB/T 6682一级水要求。 4.2 营养肉汤：见附录A的A.1。 4.3 肠道增菌肉汤：见附录A的A.2。 4.4 2×Premix Taq缓冲液：内含Taq DNA聚合酶1.25U/25μL，4 mmol Mg²⁺，dNTP各0.4 mmol。 4.5 特异性引物序列： 上游引物：5’-CAGGTGAAGGTGGAATGGTTGT-3’； 下游引物：5’-CTCTTTCCTCTGCGGTCCTAGTTA-3’。 4.6 琼脂糖：电泳级。 4.7 Marker 2000。 4.8 大肠杆菌O157 CICC 21530。 4.9 50×TAE缓冲液：见附录A的A.3。 4.10 6×上样缓冲液：见附录A的A.4。 4.11 EMA溶液（0.2 mg/mL）：见附录A的A.5。 4.12 溴化乙锭（10 mg/mL）。 4.13 灭菌离心管：1.5 mL、15 mL。 5 仪器设备（部分）