SC/T 7202.2-2007 斑节对虾杆状病毒病诊断规程 第2部分:PCR检测法 SC/T7202.2-2007 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 65.020.30
中华人民共和国水产行业标准
SC/T7202.2—2007
斑节对虾杆状病毒病诊断规程
第2部分：PCR检测法
Diagnostic Protocols for Penaeus monodon-Type Baculovirus (MBV)of Penaeid Shrimp
Part 2: PCR Method
2007-06-14发布
2007-09-01实施
中华人民共和国农业部
SC/T7202《斑节对虾杆状病毒病诊断规程》分为个部分：第1部分：压片显微镜检查法；
-第2部分：PCR检测法；
-第3部分：组织病理学诊断法。本部分为SC/T7202的第2部分。
本部分的附录A和附录B为规范性附录，附录C为资料性附录。本部分由中华人民共和国农业部渔业局提出。本部分巾全国永产标准化技术委员会归川。SC/T 7202.2—2007
本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站。本部分主要起草人：黄健、杨泳、陈爱平、来晓玲、史成银、杨从海、魏琦。斑节对虾杆状病霉病诊断规程
第2部分：PCR检测法
SC/T 7202.2—2007
1警告一使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题。使用有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。2范围
SC/T 7202的本部分规定了斑节对虾杆状病毒病PCR检测法的原理、试剂与材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。
本部分适用于进行病愿筛查和疾病的确诊。其中核型多角怀基因保守序列法仅适用了对虾，包括对虾活体、粪便，以及冰冻和冰鲜虾产品的MBV的筛查和疾病的初步诊断。·单独使用时不适于对病毒量或感染活性的估测以及宿主感染程度的评估。：3规范性引用文件
下列文件叫的条款通过木标准的引用而成为代标谁的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不括用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注月期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SC/T7202.1一2007，斑节对虾析状病蒂病诊断规程第1部分：压片显微镜检查法SC/T7202.3一2007：斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法4原理
4.1斑节对虾杆状病毒病的病原和病理学特征见SC/T7202.3—2007(斑节对虾杆状病森病诊断规程第3部分：组织病理学诊断法）中3.1的魏定。
4.2技术原理
聚合酶链式反应(polymcrase chain reacicon,PCR)足以待测样品的段DNA作为模板，以与模板两端序列互补的-对特异性寡核皆酸序列作为引物，在四种脱氧核核苷一磷酸存在下，利用依赖DVA的NA聚合酶的合成作用。经过数十次变性、退火和延仲的反成循环，使模板上介乎两个引物之间的TNA片段得到特异性地级数扩增，再通过电泳等手段检测到被特异性扩增的片段，从而可揭示微量病声DNA的存在，套式PCR是在第一步PCR护增的产物内，再用一对引物进行第二步PCR扩增。5试剂和材料
5.1除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸水或去离子水或相当纯度的水。5.2光水乙醇。
5.3液体石蜡，
5.4含氯消毒剂：医用或水产药物。5.5琼脂糖：电泳级。
5.61khDNA分了量标准：生化试剂，SC/T7202.2—2007
5.710×ICR缓冲液：生化试剂,随TagINA聚合酶提供，-20℃保存。5.8MgCl（25mmol/L）：牛化试剂，-20C保存，5.9dNTP(10mical/L)：生化试剂，含dATP、dTTP、dGTP和dCIP各10mmal/L的涯合物，-2C保。
5.10TagDNA聚合酶（5UI/uL）：生化试剂，一20保存：5.1110μmol/L引物FI:S'-ACY-TAY-GTG-ICA-GAC-AAC-AAA-TAY-TAC-AAA-3',序列含有箱并碱基，其中：Y一T或C,用于杆状病毒多角体基因保守序列法，…20℃保存。5.1210umol/L号物R1:5-GGY-GCG-TCK-GGY-GCA-AAY-TTY-TTW-ACY-TTR-AA-3',序列含有简并碱基，其中：Y=T或C,K=T或G,W·A或T,R=A或G,用于纤状病毒多角体基因保守序列法201℃保存。
5.13IE缓液按附录A的规定执行
5.14抽提缓冲液按附录A的规定执行，5.1510xl/L乙酸铵按附录A的规定执行。5.16平衡酚按附录A规定执行。
/氯价/异必醇（25:24:1)按附录A的规定热行。5.17E
5.181×电泳缓冲液按附录A的规定执行。5.196×载样缓冲液按附录A的规定执行。10mg/mL溴化乙锭（FB)忙存液按附录A的规定执行。5.201
70%乙醇接附录A的规定执行，
阳性对照为已知MBV阳性的组织或举便样品的DNA模板，一20C保存。阴性对照为已知MBV阴性的组织或粪便伴品的DNA模板，20℃C保存，5.23
5.24空白对照以无菌双蒸水为模板。6仪器设备
6. 1 PCR 仪。
6.2电泳仪：输山直流电压0V~600V。6.3水平电泳槽：50mL~500mL，带有5cm20cm宽度的凝胶船及相应的样孔梳。6.4紫外规察仪：可遮挡可见光下扰，在230am1~300mm波长对凝胶发射紫外线，推荐带照相机架。6.5台式高速离心机：转速12000r/nin以上：6.6手掌离心机：塑料转头，转速2000t/rin--4000r/min。6.7水浴钢bzxz.net
6.8普通冰箱：具冷藏箱，并带18℃以下冷冻箱体。6.9微量移液器：量程0.5105u4040u--200μ20010006.10电炉或微波炉等其他加热设备。6.11医用剪。
6.12医用镊子
6.13三角烧瓶：容量100mL~250mL。6.14坡增研磨摔或塑料研磨棒：用于在1.5ml.塑料离心管中研磨样品6.151.5mL塑料微量离心管：经高压蒸汽灭菌，一次性使用6.16灭菌0.2mLPCR管：经高压蒸汽火菌，次性使用2
6.17微量移被器枪头：经高压蒸汽灭菌，一一次性使用。
6.18塑料或乳胶手套。
6.19.吸水纸。
7操作步骤
7.1杆状病毒多角体基因保守序列法7.1.1反应体系的准备
7.1.1.1PCR反应可选择25uL、50L或.100L反应体系进行，SC/T 7202.2—2007
7.1.1.2在PCR前区按表1的要求，加人除T酶以外的各项试剂，配制成无酶反减预混物。按10份/支或100份/支分装，保存乎-20℃。在脑用前，根据研需的反成份数，取出无酶反成预混物，加人相应休积的Tag酶，混勾，即成完全的反应预混物。按1份/支分装到0.2mLPCR管中。如果PCR仪不具备热盖功能，征向各管内加人50uL腋体石蜡。替存于4七。表1.：100份PCR反应预混物所需试剂组成试剂
10XPrR缓冲液
Mgr2(25 mmol/L)
ANTP(10 mnial/L)
[物FI(10 μnol/L)
物 R1(10 jmo/L)
灭菌双燕水
TanDNA聚合酶(SU/μL)
100份反应总体积
25体系
250 ,L
1815μL
2400gL
50体系
100 gL
: 75 μL
20 μL
100zT.体系
200jgl
150 gL
7260μL
.40 μL
.9.600pl.
试剂整浓度
2.0 mmol/L
200jimal/L
0.15 pinr/L
0. 15 rmol/L
注：25μL体系慎板量1μuL/反应管;50L体系模板量2l./反应管;100uL体索模板量4,L/反应普。7.1.2样品准备
7.1.2.1样品采集的要求按SC/T7202.1一2007（斑节对虾杆状病声病诊断规释：第1部分：压显微镜捡查法)随录B的规定执行。7.1.2.2活体或冰冻幼体、仔虾个体样品约5ing~-100mg（去掉幼虾眼）；活体或冰冻幼虾或成虾肝膜腺或粪使样品5mg-100mg。上述待检样品放入灭菌1.5ml，料微量离心管中。7.1.2.3必颈避免各样品问的交叉污染。所有非一次性使册的样品处理工具要经清洗，然后漫了新配制的有效氯含量为3.0×103的含氯消毒剂中5min，经无PCR物污染的自来水充分清洗，再经蒸留水淋洗后方可宁下个样品。
7.1.3DNA 的提取
7.1.3.1样品DNA的提取应在样品区完成。7.1.3.2在样品剪碎后加人抽提缓冲液500L，用研磨棒充分研磨，37℃温浴1h7.1.3.3：加人2.5μL20mg/mL蛋白嗨K，至终浓度100μg/mL，混勾后胃于50C水浴3h，不时旋动7.1.3.4将溶液冷却至室温，加人等体积平衡，颠倒混合10min，于10000r/min离心3min分离两相。
7.1.3.5水相移至新塑料微量离心管中，加人等休积酚/氟仿/界戊醇，颠混合10mx，宁10000r/rmin离心1min分离两相。
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7.1.3.6水相移至一新火菌微型离心管中，加人等体积氯伤/异戊醇（24：1），颠倒混介10mim，于10000r/min离心1min分离两相。7.1.3.7水相移至一新灭菌微型离心管中，加人100工10mol/L乙酸铵，混勾后，再加人两倍体积预冷无水乙醇（-20℃）混勾，一20℃放置2hc1000mr/min离心10ri弃上清液。7.1.3.8用70%乙醇洗涤沉淀2次，存次100x00r/min离心5rmill，小心倾去上清液，最后沉淀于室温晾平。
7.1.3.9沉淀晾平后咖入1X)μL灭菌双蒸水溶解DVA，7.1.3.10若TNA样而需要保存，建议溶解于100LTE缓冲液巾并保存于20C，7.1.4PCR扩增
7.1.4.1在PCR前区，按照表1对各反应体系所需的模板体积要求，问各支含有1份反应预混物的PCR管帽工，分别加入相应体积的各样品的DNA提取液。并设阳性对照、阴性对照和空向对照。7.1.4.2将上述加有样品模板的PCR管带人PCR后区，置于预热到94C的PCR仪中保温5min，遂只依次快速取出并在于掌型离心机上短暂离心1s2，使管益上的样品模板人反应预混物中，再立即放回预热的PCR仪中，继续在94C保温3min，再按以下程序进行扩增：95℃:1nin、45C1mi72℃1min，35个循环；72℃5min.最后4%保温。准备进行产物的电泳，7.1.5琼脂糖凝胶的制作
7.1.5.1在电泳区用1×电缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶，建议」一角烧瓶中配制，在电炉上或微波炉中热至溶液完全透明（为避免煮沸时液休外溢，胶液体积应少于容器体积的1/4)：得溶液冷却举60℃左右，人10m/mL漠化乙锭（EB)（有薄）至终浓度0.5g/mL，揉。7.1.5.2将凝胶液缓缓倒人设置好样孔梳和防漏条/套的水平放置的凝胶，胶液厚度0.61--0.8cm。样孔梳底部水平深入凝胶层约0.3cm--0.5cm，并距凝胶底部0.2cm，以免穿透。7.1.5.3待凝胶究全凝固后，小心拔掉样孔梳，去掉防漏条/套，即可用宁电泳。7.1.6电泳
7.1.6.1将制备好的琼脂糖凝胶连同凝胶船-·起装入水平电泳槽，加样孔应朝向负极，加人1×电泳缓冲液至没过胶南约1mm2mm的深度。7.1.6.2将10LCR反应产物与2叫6×载样冲液混句后加人到样乱中，同时至少设个道加入5uLIkbDNA分子量标准的载样混物。7.1.6.3盖上电泳槽并通电，使DNA由阴极向阳极移动。在1V/cM-5V/cm的电压下电添约1h，当截样缓冲液中的溴粉蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的1/2--2/3处时停止电泳，将疑胶置丁紫外观察仪上观察或照相。
7.1,7分子量计算
7.1.7.1谢定分子量标准的每条区带到加样孔的迁移距离（即泳动率）,将各区带分子量的对数值对其动率作图，各点的排列应该接近是一条下降的直线，画山其趋势线，求出分子量计算的回归方程。7.1.7.2测量各样品泳道出现的条带的泳动率，利用分子量标准所得山的分子量计算的回归方程，计算各条静的泳动率。
7.1.7.3出于凝胶在电泳时，其中的温度和电场的不均性，以没电泳时所加样品的离了强度或DNA浓度的差异，相同分子量的DNA片段在凝胶中的泳动率会有所差异，各条带分了量的实际测量的结果充许有1%~~3%的误差。
7.1.8后处理
观察完率的凝胶和污染有PCR物或EB的一次性用品和溶液，应立即按附录B的规定处理：4
8结果判定
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8.1核型多角体基因保守序列法中阳性对照在674碱基对（bp）处会有一条特定条带出现：阳性详品在674bp处会有特定条带出现；阴性对照和阴性样品在674bp处应无条带出现，空白对照不出现任何条带。阳性对照在674bp处无特定条带出现或阴性对照在674bp处有条带出现部表明PCR失败，成在排除故障和清除污染后，重新取样检测。斑节对虾杆状病毒病PCR检测产物序列参见附录C。8.2条带的亮暗表示扩增产物浓度的多少，但并不对了模板的最的多少。8.3阳性结果表明被检样品中存在MBVDNA对活虾和敏感宿土而言，提示已受MRV感染：对冰鲜对虾而言，提示曾受到MBV感染：8.4电泳结果的分析和间题排除方法参见表2。表 2 电泳结果分析
实验结果
对虾样品
核型多角休基因保守序列法中阳件对照和附性样品在674处有条带，阿性对照利白对服无 674 条带
阴性对照有条带，但分了量标准波有彩像
分子量标雅有彩像，但阳性对照无条带
梭型彩角体基固保守序列法中阴性对照或空自对照在674bp处有条带出现妇性对照和阴性对照纽正常，但已知带牵伴品,兀柔带
分了堂标窄正常，但阳性对照，阴件对照和样品出现较多杂带或明靠的弥散区结果判读及原因分析
1.FCR反应正常、结果有效
1.分了量标准失效或圳样量太
1.ICR反应失败
2.阳性对照失效
1.微量移波器污染
2.试剂污染
3.环境污染
4.染作污染
1.LNA提取尖败或降解
2.TNA不纯或DNA浓度过高
3.PCR抑制物介人
1.未注意热启动操，使PCR
排现非特异性扩增
2.薄活性、INTP浓度或Mg3-浓
度差异
3.温度控制异弯
阿题排除
重换分子量标准或增加其加样益格查并更换PCR反虚断刑试剂以及PCR程序是否正
更换阳性对照，重新实验
清洗微蛋移液得，只能用PCR所区的微量移教器胞必冰
重换战剂
消活实验密及所用仪器设备，先附录B禁止从 HCR后区到 PCR前区的交流，加强携作攝离
检查翌取DNA所用试剂情况，重新实验,确认样品新鲜程度
用OD0/OD2比值求确短：其正常比值应在1.6--1.8之间，低下1.6则表示蛋自质过多
垂新提取LDN
微好热启动操作。样品先要加到PCR管盖上，反应预混物预燃后，短暂离心(1 9~2 s)以据人样品,迅速放回频热 PCR仪中
确认预混物制备的准确性，试剂应量，对不同批次的酶重新测定最佳M-离子浓度
检查FCR仪息否复性温度过低
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实验结果
凝胶上无任何影像，包活DNA分了量标端
表2２【续】
结果判读及原因分析
1.紫外观察仪故障
2.背景发红太亮
3.凝胶太原
4.电极颠倒或电泳时问过长
5.EB分解失效
澳化乙筑(EB)有，试剂的操作和废弃物的处理按附录B的规定执行。6
问题排除
检查案外观案仪
战少EB*用摄，将琼唱糖凝歧置于消水中30 min后再观密结果
电新制作垢辨凝胶片
改正电极方向，重新加样电漆
重新配削溴化乙锭(FB)
A.11 mol/LTris-HCI(pH 8.0)
附录A
(规范性附录）
试剂配方
800 naL
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溶解后加入约42㎡L浓盐酸调pH接近8.0，冷却至室温，再用2.5mol/LIICI调整pH至8.0加水定穿至
分装后，高压蒸汽灭菌,室温贮存、A.20.5mol/LEDTA(pII8.0)
乙二胺四乙酸二（EDTA-Na·2HO）水
1 000 mL
：磁力搅拌，用2.5mol/LKaOH调节溶液pH至8.0，完全溶解，定容至100mL高压蒸汽火菌，室温贮存。
A.3TE 缓冲液(pH8.0)
..1mol/LTris-IIC(pH'8.0)
0.5 mol/L EDTA( pH 8:0) : .
加水定容至
高压蒸汽灭菌，4℃贮存。
A.41mg/mL胰 RNA酶
胰RNA酶
TE缓冲液(pH 8.0)
1 000 mL
溶解后，F100C加热151nin，缀慢冷却至穿温，分装100uL/管；-20℃贮存。A.510%SDS
SLXS(十一烷基硫酸钠）
P:90inL
加热全68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pFI至7.2加水定容率100mL。室温贮存。若溶液有结晶形成，用前加热融解即可。SLS微细品粒易于扩散，称量时要戴而罩，称量完毕后要清除残留在称量工作台区和天乎平上的SDS.
A.6抽提缓冲液
1 mol/I.Tris-HCl(pH 8.0)
0.5 mcl/L EDTA(pH 8.0)
：-1ml
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1 mg/mL 胰RNA酶
10%SLXS
加水定容垒
混句,室温贮存。
A.720 mg/mL蛋白酶K
蛋白酶K
100 ml
溶解后分装丁无菌离心管巾（0.25mL/管）-20℃下保存。A.810 ml/L乙酸铵
乙酸铵
加水定容至100ml.,经0.45m滤膜过滤除菌。4℃贮存。A.9平衡酚
推荐直接购买市售的平衡酚。若无市售平衡酚可用，采用以下方法制备。将苯酚品体子68℃融化，用空气冷凝管蒸馅进行重蒸馏，收集160℃的馏份于三角烧瓶中。冷却后，加入8-羟基喹啉至终浓度为0.1%，用0.5mol/LIris-HC(pH8.0)抽提一次,再用0.1mol/LTrisHICl(pHI8.0)拍提数次，短次抽提用磁力搅拌器搅拌15min,然后静置30min分层，尽可能完全地抽出上层水相。水相的TI大于7.8后即达到平衡，置棕色玻璃瓶中，上面双盖0.1休积含0.2%β巯基乙醇的0.1mol/LTris·HCl(pH8.0)液层，4℃贮存，-个月内使用。注：酚腐蚀性很强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套和防护镜，穿防护服。所有操作均应在化学通风掘内进行。与酚接触过的皮肤应立即用大量水冲洗，并用肥启和水洗涤，忌用乙醇。A.10酚/氟仿/异戊醇(25:24:1)
平衡酚
异戎醇
D.01 mol/L Tris*HCl(pH &.0)
混后，自然分层，置十棕色瓶内，4℃贮存，1个月内使用。4.1150×电泳缓冲液
冰乙酸
0.5 mol/L EL)TA(pH 8.0)
加水定穿率
室温贮存。
4.121×电泳缓冲液
50×电泳缓冲液
加水定容至
室温贮存。
1 000 mL
1000 mL
A.136×载样缓冲液
加水落解，定容至
溴酚蓝
溶解后，4℃贮存。
A.140.5mol/LK.MnO4
加水溶解，定容至
室温贮存。
A. 152.5 mol/L, HCl
在500mL水中加人浓HC（37%HCI)混勾并冷却店，肌水定容至
室温贮存。
A.16 2.5 mel/1. NaOH
媚水 700 ml.溶解;冷却后定容垒40 g
.0.25g
1 000 rrL:
.246.35mL
1 000 mL
1000 mL
置于聚丙烯塑料璇中，旋紧瓶盖，室温贮存。A.1710mg/mL溴化乙锭（FEB)贮存液溴化乙锭(EB)
磁力搅拌数小时以确保具先全溶解。室温保行于棕色瓶或用铝铂包襄的瓶中。SC/T 7202.2—2007
溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性，称母时应戴面罩和于套，避免溅酒，试剂瓶应注明，使用时应戴于套，参见附录B
A.1870%乙醇
无水乙醇
加水30mL，混勾，定容至
分装后,室温贮存。
100 mL
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附录B
【规范性附录】
PC浪实验室要求和化学药品及仪器设备操作要全注意事项B.1PCR实验室分区
PCR前和PCR及ILCR后的工作范用必须分区成为相互隔离的实验室，所需试剂、仪器、实验室备种用品、工作服等均应独立使川：长期从事常规性PCR检测工作的人员包应进行专门分工。专用丁进行套式PCR检测的实验室应分为四个隔离的区城（房间），包括洁净区、样品区、扩增区和中泳区。洁净区和样品区属丁PCR前区，扩增区和电泳区属于PCR启区。其中洁净区专用于配制利分装PCR所用试剂，不应该接触任何样品；样品区专用于进行样品的处理和第一步PCR的加样，不应该接触任仙PCR产物：扩增区专用J进行PCR循坏环和第二步PCR的如样，不应该暴露第步PCR产物，山于暴露第一步PCR产物也可能造成严重污染，必须对扩增区经常进行产物污染的消除处理；电泳区专用于PCR产物的检测。只允许从洁净区→样品区-增区→电泳区的单向物流，同时FCR后区应该尽可能避免各步PCR产物的污染。应定期对专门从事PC浪的实验室各区的产物污染程度进行测试评估，开有针对性地进行消除产物污染的处理。
B.2含PCR反应产物的材料
PCR反应产物的不当处理会造成实验室的严重污染，含PCR反应产物的用品，如抢头、离心管，凝胶和乎套等必须用3.心×101-\浓度的含氯消毒剂溶液处理后，再以塑料袋密时包装后丢弃，含有PCR反应产物的溶液必须加人含氯消毒剂达30×10-3的浓度，经处理10min以上后方可直接倒人下水道口，可能沾污PCR反成产物的衣物、桌椅、拖把、扫帚垃圾桶等严禁带人PCR前区。需保存的ICR产物只能密时保存在PCR后区
R.3溴化乙锭
漠化乙锭为致痴物，有中度性，可通过皮肤或黏膜吸收，对坏境有污染，需要按照以下方法来逃行操作或处理。
【1]溴化乙锭浓溶液的净化处理加人足量的水使漠化乙锭的浓度降低至0.5rmg/rmL以下。划入1倍体积的0.51mol/LKMnO4，小心混勾后再切1倍体积的2.5mol/LHCl。小心混匀，于室温放置数小时。加人1倍体积的2.5mol/LNaOH,小心混约后可丢弃该溶液。0.5mol/LKMO42.5mol/LHCl.2.5mol/LNaOH按附录A的规定。【2]漠化艺锭稀落液的净化处理每100mL溶液中加人100ing粉状活性炭，了温放置1h，不时摇动。用Whatnuanl号滤纸过滤溶液，丢奔滤液。：用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物处理。【3]漠化乙锭固体的操作
应避免吸人或食人漠化乙筑的固体或粉尘。操作人员要穿戴实验服及于套，妇果不慎沾到皮肤，抑用大量清水冲洗。
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