SC/T 2047-2006 水产养殖用海洋微藻保种操作技术规范 SC/T2047-2006 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS65.150
中华人民共和国水产行业标准
SC/T2047—2006
水产养殖用海洋微藻保种
操作技术规范
Technical specification for germplasm grade and preservationof marine microalgae using in aquaculture2006-07-10发布
2006-10-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准的附录A、D、E是规范性的，其余是资料性的。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国水产养殖标准化技术委员会海水养殖分技术委员会归口。本标准起草单位：苏州大学，江苏省海洋水产研究所。本标准主要起草人：陈葵、陈淑吟、吉红九、沈颂东、贺丽红。品伙伴网httn：//foodmate：SC/T2047—2006
1范围
水产养殖用海洋微藻保种
操作技术规范
SC/T2047-2006
本标准给出了水产养殖中常用海洋微藻保种的术语和定义、设施设备和条件基本操作与日常管理、藻种来源和分离纯化、藻种保存培养、室内小型扩增培养及藻种种质库的建立与管理方法。本标准适用于附录A所列水产养殖用海洋微藻的保种。其他海洋浮游微藻可参照执行。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB11607渔业水质标准
3术语和定义
水产养殖用海洋微藻marinemicroalgaeusinginaquaculture用于水产养殖动物苗种培育、动物性饵料生物、经济双壳类成体的饵料、净化水质的海洋单细胞藻类，水产养殖常用海洋微藻种类参见附录A。3.2
藻种microalgaespecies
具有良好特征性状，新鲜无污染，细胞密度在10个/mL～10个/mL之间的微尊单种或纯种3.3
接种inoculation
在无污染的条件下，把选中的藻种放人新备好的培养基中的操作。3.4
单种培养xenic culture
培养过程中，海洋微藻的培养系统内含有细菌（或不含细菌）和要培养的海洋微藻而没有其他生物。3.5
closed culture
封闭式培养
藻类培养在封闭的容器中，只通过充气管、培养液加人管和藻液抽出管与外界接触。3.6
一次性培养
batch culture
指在有限容积的培养容器中，加入定量培养液，接人藻种，藻细胞生长繁殖达到较高密度时，不加人或不更换培养液，一次性全部收获的培养方式。3.7
半连续培养
semi-continuousculture
指在一次性培养的基础上，藻细胞生长繁殖达到较高密度时，收获部分藻液，置换等量的培养液，再1
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培养再收获的培养方式
连续培养
continuousculture
指使用封闭式自动培养装置当培养容器中藻细胞密度超过规定数值，藻液自动流出，新培养液同时流人，自动化仪器不断调整流出率，保持藻液细胞密度相对稳定的培养方式。3.9
继代培养subculture
保种培养过程中，经过一定时间之后，把藻种接种在新培养基上，先放置在适宜条件下生长一段时间后，再放人低温（5℃～8℃），弱光（501x～2001x）条件下，一代一代培养下去的方法，接种一次可保藏3个月一12个月。
4设施设备和条件
4.1水质
符合GB11607。
4.2设施设备
4.2.1海水处理设施
室外蓄水池、沉淀池、暗沉淀池或砂滤设备、通入室内的输水管道。4.2.2清洗消毒间
用于容器和器材的清洗消毒，可分清洗间与消毒间。配有清洗消毒水槽、不同规格玻璃器皿，玻璃器血放置架、臭氧紫外线消毒柜、烘箱、紫外线灯、工作台、电炉或煤气灶，高压蒸汽灭菌锅及载物架等。4.2.3培养操作间
进行培养液的配制及微藻的保种、培养及检查等操作的房间。配有PH计，分光光度计，化学试剂。药品柜、电子天平、光学显微镜、超净工作台、无菌室等。4.2.4保种间
用于放置低温培养箱、恒温光照培养箱、冰箱、冰柜，保存藻种、存放浓缩藻液的房间。4.2.5小型扩增培养间
进行微藻小型扩增培养的具有控温设施的房间。要求房间采光、通风良好。配置气泵、带人工光源的培养架、遮光帘等。
5消毒灭蕾和营养液配制
5.1消毒
5.1.1微藻分离、保存用的海水在使用前需经灭菌处理。一般煮沸5min~10min，用保鲜膜封口，冷却至室温后备用。
5.1.2玻璃器血用洗液或稀盐酸泡洗5min~10min，再用清水冲净，倒置凉干，放人烘箱，120℃~160℃灭菌1h2h。
5.1.3有培养基的器Ⅲ先去掉培养基再按5.1.2的要求洗涤5.1.4其他不易清洗的容器，先刷洗干净，再按5.1.2的要求冲洗。5.1.5不能用烘箱烘干的器具放于消毒柜消毒或用煮沸的方法处理。5.2培养液配制
5.2.1总要求
一用蒸增水或消毒海水配制：
各种营养成分应进行无菌处理：一试剂质量应达到或高于化学纯：微量元紧维生素，按比例配成1000倍浓度的母液：大量元素（包括有N、P、FeS等）营养盐单独配制成1000倍浓度的母液：母液保存于4C冰箱中备用：
一母液使用前必领摇匀，出现沉淀或被污染应弃之另配。5.2.2常用培养液配方
各种常用微藻培养液的配方见附录B。5.2.3培养液配制
各成分加人顺序为N、P.Si、FeEDTA-Na2Ve等一每加人一种成分应搅均后再加人另一种。一微种保存时所用培养液中最后可加人适量抗生素。6藻种来源和分离纯化
6.1来源
6.1.1野外采集
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在要采集藻类的生长季节地区，采集有需分离藻种的水样，并记录采集地的理化条件。野外采集的水样须经过分离纯化、鉴定后保种。6.1.2引进
从有资质的其他海洋微藻保种单位引进海洋微藻藻种。6.2分离预备培养
根据要分离的操类的要求，调节温度光照度，盐度酸碱度等，将要分离的操类富集培养至可进行分离的细胞密度。主要的微藻种类适宜生长条件见附录D6.3分离
6.3.1微吸管分离
适于分离个体较大的藻种。用玻璃微吸管吸取单个的所要的藻细胞后移人准备好的容器中培养。6.3.2水滴分离
适用于在培养液中已占优势的藻种分离。把水体稀释到每一水滴只有一个藻细胞，吸出水滴在显微镜下检查到有需要的藻细胞时，将水滴冲人试管培养。6.3.3平板培养分离
适用干所含藻种品种较少的水样。把稀释适当的水样喷酒在固体培养基上，或用接种环罐取水样后在固体培养基上划线，然后置于适宜条件下培养来分离出藻种。6.4纯化培养
将分离出的藻种进行单种培养，使其增殖到保种所需要的细胞密度。6.5鉴定种类
纯化培养后的藻种经藻类分类学鉴定，确定种类。7藻种保存培养
7.1低温保存
7.1.1条件
采用低温培养箱。控温为5℃～8t，光照度为50x~200lx，光周期14D:10L，静置。3
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7.1.2要求
用试管或150mL一250mL，的三角烧瓶保存，，每种保存有相继的三代落种，固液双相和固相保存同一种质材料各3管（瓶）以上。7.1.3培养基配制
固体培养基营养成分的浓度为正常培养液配方的2倍。在配好的培养液中加人1%2%琼脂，加热溶解后，分装至培养容器中。一试管的培养基倒人量为试管长的1/4，三角烧瓶的培养基分装厚度为0.8cm1cmg试管口和三角烧瓶口塞好棉塞或牛皮纸包扎好后进行高压蒸汽湿热灭菌。灭菌后取出，试管倾雪成斜面，三角烧瓶平放，原冷备用。7.1.4固相保存
7.1.4.1接种
一用划线法将藻种接种到试管中；一用喷雾法把藻种接种于三角烧瓶中培养基表面。7.1.4.2保存
先放于适宜的温度光照条件下培养，至接人藻种生长正常，可见明显的藻细胞群后，移人低温培养箱中保存。不定期观察藻种的保存效果。一般保存半年至一年，再作传代培养。7.1.5固液双相保存
7.1.5.1接种
在含有固体培养基的三角烧瓶中，先倒人双倍于固体培养基的培养液，再接人适量的薄种，或把藻种直接加人到含有固体培养基的三角烧瓶中7.1.5.2保存
适当温度光照，培养3d5d后移人或直接置于低温培养箱中。3个月~6个月，更换1~1/3的培养液，或作传代培养。
7.2常温保存
7.2.1条件
采用恒温光照培养箱培养。控温在18℃-22℃.光照度为10001x~30001x，光周期12D:12L。7.2.2要求
-培养容器为250mL~1000mL三角烧瓶一每一种类各保存3瓶以上。每天摇瓶2～3次。易沉淀藻类用慢速摇床振荡培养保持藻细胞悬浮。一—封闭式培养。
7.2.3接种
加入藻种与培养液比例为1:3～1:27.2.4添加培养液
每15d~30d，添加或更换1/2~13培养液或作传代培养8日常管理
8.1观察及处理
藻种生长良好时，藻液颜色逐渐加深，无附壁，无沉淀。如发现有异常，立即取出、去除，并及时接种培养补上空缺的藻种。
8.2显微镜检查bzxz.net
一观察藻细胞的增殖情况、计数。计数方法见附录C。—检查被污染情况。
一藻种取样时必领无菌操作
8.3室内消毒
每15d~20d消毒一次。在进行无菌操作前，用30W的紫外线灯消毒1h。8.4记录登记
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每次检查，接种及营养盐添加，需直接在培养容器上及记录卡上分别登记列存。日常操作及观察结果作书面记录。日常管理记录卡的样式见附录E中表E.2。9室内小型扩种培养
9.1培养条件与接种措施
9.1.1培养条件
一温度：按培养藻种要求调控室温。光照：自然光照结合人工光源，按藻种培养要求调节光照度、光周期。一通气：气泵的供气量按培养容积的1%提供。供给气体需经1%的硫酸铜溶液或空气过滤器过滤后，接人培养容器底部，保持集液均勾悬浮，9.1.2各主要海洋微藻生长的生态条件各主要海洋微藻最适宜生长的条件见附录D9.1.3接种时间
在上午8时~10时。
9.1.4培养方式
为封闭式一次性培养或半连续培养。9.1.5营养盐添加
扩增培养时，在充气状态下按顺序将高浓度母液（1：1000）直接添加于培养容器中，按培养液终浓度200g/L～400u/L的量添加青霉素及硫酸庆大霉素。9.2扩种方法
9.2.1一级培养
9.2.1.1培养容器
采用5000mL～10000mL的三角烧瓶或其他容器9.2.1.2藻种与培养液比例
藻种与培养液比例为1:10~1:5。9.2.2二级培养
9.2.2.1培养容器
用容积为50000m~100000mL的微膜气升式光生物反应器或透光良好的聚z希桶9.2.2.2藻种与培养液比例
藻种与培养液比例为1:20～1=10。10藻种种质库的建立和管理
10.1海洋微藻种质库的建立
限据需要按本标准要求建立专门的海洋微操种质库。10.2海洋微藻种质库管理
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10.2.1藻种入库
海洋微藻藻种人库前必须确定藻种的学名和中文名。无法定种的，确定其属名。按照学名或中文名拼音字母顺序排列编号。一人库时即建立保种档案卡。
一不同的藻种采用与其保藏培养相适的保种条件和保种技术。每个藻种预留3~5个备份。
10.2.2藻种种质标记
所有入库保存的海洋微藻藻种都必须有专一的种质编号。采用海洋微藻藻种种质档案卡及保存卡（附录E）的形式进行记录。
食品伴网httn：//wwwfoodmate:ne附录A
（规范性附录
水产养殖常用海洋微藻种类
水产养殖常用海洋微藻种类见表A。表A水产养殖常用海洋微藻种类
中文名称
亚心形四扁藻
绿色杜氏藻
小球藻
三角褐指藻
小新月菱形藻
牵氏角刺藻
中肋骨条藻
球等鞭薄QA-3011
球等题藻OA-3010
湛江等鞭藻
绿色巴夫藻
眼点拟球
异胶藻
Tetraseliris suboordiformis(Wlle)HazenDunaliella viridis TeodoregcoChiorella spp
Phaeocactoyum tricormturn BohlinNitzschia closterium f.minutissima(W.Smith)Allen &NelsenChnetoceros muielleri LermmermainnSheletomema costatun Grevillesochrsis galbana Parke OA-3011Isochrysis galbana Parke OA-3010Isochrysis zhangjiangensis Hu & LiuPauleen ziridis Tseng,Chang & ZhangNamnoehloropsis ceulata DroopHeterogloea sp.
http：//foodmate.netSC/T2047—2006
所属门
绿藻门
硅藻门
金藻门
黄藻门
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硅藻培养液
硅藻培养液配方
硅藻培养液配方F/2见表B.1.1。附录B
（资料性附录）
常用海洋微藻培养液配方
表B.1.1硅藻培养液F/2配方
Na SiO
微量元素母液
维生素母液
B.1.2微量元素母液
硅藻培养液的微量元素F/2配方见表B.1.2。用
8.4mg-16.7mg
1000ml
硅藻培养液微量元素F/2配方
ZnSO.·4HO
MnCl·4HO
CuSO.·5HO
FeCHO*5HO
NagMoO·2HO
CoCh-6H20
Na2-EDTA
蒸馏水
维生素母液
硅藻培养液的维生素F2配方见表B.1.3。表B.1.3
8硅藻培养液的维生素F/2配方
雏生素 Bl2
维生素B
维生素H
蒸馏水
httn：//wwwfoodmat用量
1000ml
1000mL
绿藻培养液配方
绿藻培养液配方见表B.2。
MgSO.-7HO
FeCh-6HO
3金藻培养液配方
金藻培养液配方见表B.3。
FeCgH.O（1%溶液）
维生素B
维生素 B2
海洋微藻通用培养液配方
海洋微藻通用的培养液配方见表B.4。绿藻培养液配方
金藻培养液配方
海洋微藻通用培养液配方
NasSO（硅藻类用）
FeC.HO(1%游液）
Na-EDTA
维生素 B
维生素 Bl2
Na-EDTA
httn：//foodmate用量
1000ml
1000ml
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50mg~120mg
3mg-8mg
0.2mL~1ml
3mg~5mg
100mgg~200mg
200mg~500mgg
3mg~5mg
1000ml
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C.1器材
附录C
规范性附录）
微藻细胞计数方法
医用血球计数板一个，计数器一个，载玻片、盖玻片若干，微吸管一只，光学显微镜一台。C.2操作
C.2.1医用血球计数板及盖玻片清洁、控干，平放桌上，盖好盖玻片。C.2.2待测藻液样品摇勾，即用一支干净的微吸管吸取样品，快速把吸管口放于盖玻片边缘，使液流人盖玻片内，并覆盖满划线方格及其周围。C.2.3稍停1min，显微镜下计数。C.3计数
医用血球计数板上计数区的划线方格有大格、中格、小格之分，只计数分布于中间的25个中格的微藻细胞数，计数2～3次，取平均数。藻细胞密度(10*个/mL）=25个中格的藻细胞数的总和。10
http：://foodnate.ne
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