本部分规定了鱼类柱状嗜纤维菌细菌性烂鳃病的诊断方法。本部分适用于鱼类细菌性烂鳃病的诊断。 SC/T 7201.2-2006 鱼类细菌病检疫技术规程 第2部分：柱状嗜纤维菌烂鳃病诊断方法 SC/T7201.2-2006 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS65.020.30
中华人民共和国水产行业标准
SC/T 7201.22006
鱼类细菌病检疫技术规程
第2部分：柱状嗜纤维菌烂鳃病诊断方法Rules for quarantining bacterial diseases of fishPart 2: Diagnostic method for gill-rot disease2006-12-06发布
2007-02-01实施
中华人民共和国农业部发布
SC/T7201《鱼类细菌病检疫技术规程》分为7个部分：第1部分：通用技术：
一第2部分：柱状嗜纤维菌烂鳃病诊断方法：第3部分：嘴水气单胞菌及豚鼠气单跑菌肠炎病诊断方法；-第4部分：荧光假单胞菌赤皮病诊断方法；第5部分：白皮假单胞菌白皮病诊断力法。本部分为5C/T7201的第2部分。
本部分的附录A利附录B为规范性附录。本部分由中华人民共和国农业部渔业局提出。本部分而余水产标准化技术委员会归1。SC/T7201.2--2006bzxZ.net
本部分起草单位：中国水产科学研究院长江水产研究所、中国水产科学研究院珠汀水产研究所。本部分主要起草人：何力，邹为民、徐忠法、姜兰、周瑞琼、罗晓松。17
1范围
鱼类细菌病检疫技术规程
第2部分：柱状嗜纤维菌烂鳃病诊断方法SC/T7201.2—2006
木部分规定鱼类柱状嗜纤维菌纫菌性烂懿病（baclcrialgifl-rotdiseasx:)的诊断法本部分适用丁色类细菌性烂鳃病的诊断。2规范性引用文件
下列义件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款，凡是注日期的引用文件，其随后所有的修单（不包括勘误的内容)或修问版均不适用门本部分，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。SC/T7014-2006水生动物检疫实验技术规范SC/T7201.1—2006鱼类细菌病检疫技术规范第1部分：通用技术3病原体与流行情况
3.1主要病原体
柱状噬纤维菌（（itothagau cotumnaris）。曾用名：柱状嗜纤维杆菌、柱状屈桡杆菌、鱼害黏球菌。3.2流行情况
在青仙，草鱼、链、、鲤、鲫、酮、鳗缅等鱼中部可发生，但主要危害草位；各地一年四季出现；水温20%以上开始流行28℃-35℃为最适流行温度：4试剂
除非刃有说明，在检验中仅使用确认为分析纯的试剂、蒸馏水或去离广水。常用试剂与染色液的配制接SC/T7201.1—2006中附录A的规定执行。微生物生化鉴定管可代格相应的试剂。4.1辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗免IgG抗体，4.21%盐酸四中基对苯胺。
4.33,3-氨基联苯四盐酸盐(DAB)酶底物(见附录A)。4.4pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)(见附录B)。4.5pI7.6三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCI)缓冲液(见附录B)。4.6免抗柱状噬红维菌抗血清。
5培养基
5.1胰豚琼脂培养基。
5.2（Christensen氏怖檬峻培养基。5.3硝酸盐液体培养基，
常用培养基的配制见5C/17201.1—2006附录B升的B.4。6设备和器械
应符合SC/T7201.1—2006第4帝的规定。19
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7来样
遵照 SC/T—2006第4章的规定。8临床诊断
8.1活动情况
病鱼活动缓慢，对外界的刺激反应迟钝，呼啵困炸，食欲减退；病情严重时，离群独游水面，不吃食。8.2外部检查
体色发黑，尤以头部为甚：鳃丝工黏液增多，鳃丝胀，末端腐烂，软骨外露；鳃丝上常附卷有较多污物，不宜用水洗次病情严重时，鳃盖内表面表皮充血发炎，中间常糜烂成圆形或不规则的透明部分。8.3镜检
剪取少最病灶处鳃丝放在载玻片上，加上2滴3滴无菌水（或清水），盖上盖玻片，在400倍至600倍显微镜下观察。鱼体鳃上光大最景寄牛业真菌，放置20min～30min，可见鳃丝上有犬量细长，滑行的杆菌,有些菌体聚策成簇状。
9实验室诊断
9.1病原菌的分离
9.1.1平板划线分离
取病色鳃丝小快，置下滴有无菌水的载吸片的边缘约10min，川接种环蘸水，在胰陈琼脂培养基平板上划线。可采用平板划线方法，不重复的刻线，需尽量使其产牛单个分散的菌落：在25℃恒温养2d~3cla
9.1.2纯培养
遵照SC/T7201.1--2006的7.2.3的定。9.2菌落形态
在喷豚琼脂培养基平板上25C培养2d左右，出现稀薄的、平铺在培养基表面的菌落，边沿不整齐、中央较厚，天小不，颜色由浅逐渐变成黄色，9.3革兰氏染色
在下净载玻片上滴加一滴蒸馏水。用接种环取菌落少许与蒸馅水混合并均勾涂布，自然十燥，火焰固定；加草酸铵结晶染液染1min-2min,加水冲洗；加革兰氏碘液作用1min~2min，加水冲洗；加复红酒精染液染50s～605,加水冲洗。干燥，检。菌体被染成紫蓝色为阳性，红色为阴性。9.4生化检验
利用全自动细菌分析仪和细菌生化鉴定管可简化相应试验过程。9.4.1明胶液化试验
在胰陈培养液+加入12%的明胶，pH7.2,用高压蒸汽121℃、30min灭菌。取菌落接种培养2d~3d后用二氯化汞浇淹培养基，有液化明胶的区域出现为阳性。9.4.2酷素水解试验
在胰陈培养基4加人2%脱脂牛奶制成平板，接种2d后，平板上有酪素水解的亮斑为阳性。9.4.3淀粉水解试验
胰陈培养基加0.2%可溶性涎粉。接种培养2h～3h碘液于平板上，蓝背员中有明亮的水解区誠为附性。
9.4.4七叶灵水解试验
在0.5%的胰蛋自陈，加0.1%的七叶灵，0.05%的柠懂酸铵铁，2%的琼胎培养基上，接种培养、观20
察7d,菌落周有黑色沉淀物为阳性，9.4.5几丁质分解试验
SC/T 7201.2-2006
用0.1%的胰蛋白陈加人0.5%几质.0.2%琼脂的培养基荒于光常养琼脂平板上。接种培养.观察7d。菌落周围出现透明圈为阳，9.4.6分解纤维素的试验
在膜陈培养液中加源纸条：接种观察10d，滤纸条有缺刻或断裂等分解现象为阳性：9.4.7酪氨酸分解试验
在胰陈培养液中加（.5%的略氨酸，接种培养观察两呆期（14d），酪氮酸被分解而透明为阴性。9.4.8硝酸盐还原试验
在硝骏盐液体培养基上接称培养241后，滴加格里斯氏（Griess)试剂（配制见SC/I7201.1—2006附景A的A.2)各儿滴、10min内显红色为阳性，9.4.9靛基质试验
1%的映蛋白陈水液，接种培养2d后，滴加乙醚数滴，动，乙醚浮于上，再沿管膀滴加Kcvacs试剂约0.5ml-。两液接触处即刻攻魂位为阳性。9.4.10硫化氢试验
1%的胰蛋户陈水液，接种塔养2d--4d，用酷酸铅粉切人试管中观察。有黑色沉淀为阳性。9.4.11构酸盐利用试验
用Christeriscn氏构橡酸培养基，接种培养，观察7d。培养基由氯变蓝者为阳性。9.4.12过氧化氢酶试验
取一杯培养物与3%·10%的过氧化氢混合，有气泡产生者为附性。9.4.13葡萄糖利用试验
胰陈液休培养基加1%菊葡精，0.00)15%溴香草蓝。培养基变黄色为阳性。9.5免疫学检验
用弯头馒了取新鲜病鱼鳃上的少母淡黄色黏液，涂于载玻片上，自然晾干；加儿滴柱状噬纤维菌兔抗血清丁该裁玻片的涂片区，将载玻片置于湿盒内，在37℃C温育30mil用磷酸盐缓冲液（PBS)洗3次～4次，每次3min-5min,再加几满HRP羊抗兔Ig抗体后，置盒内，在37℃C温育30min；用PBS洗3次--4次，每次3min~5min，几滴DAB底物，反应6min~8min，用pf7.6TrisTICI缓冲淤洗301min；加滴书封存涂片区，覆上盖玻片。普通显微镜洲镜下观察。10结果判定
血清学检验，涂片上有棕色卵长颗粒，题颗粒大小与杆菌一致，或生化检验符合以下所有特性者可判定病原菌为控状噬纤维菌：
a）菌落形态特征符合9.2的规定，革兰氏染色为阴性；b）明胶液化试验、酪素水解试验、硝酸盐还原试验、过氧化氢酶试验、硫化氢试验为阳性；）淀粉水解试验，七叶灵水解试验、几」质分解试验，分解纤缩素试验、酪氨酸水解试验、靛基质试验、硫化氢试验、楠樣峻盐利用试验、过氧化氢薄试验、葡萄精利用产气试验为阴性。临床诊断结果符合8的规定，病原菌为柱状噬纤继菌，可判定为细菌性烂龈病。21
SC/T 7201.2—2006
A.1DAB酶底物
A.1.1配方
附录A
【规范性附录】
试剂的配制
A.1.1.1A剂：3,3'二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)30mg。A. 1. 1.2B剂:pI17.6 Iris-HCl缓冲 40 rmL,A.1.2配制
A剂与B剂混个后避光搅拌3h，储在棕色瓶中，放置于4℃冰箱。便用前溶液经单层滤纸过滤，取10L滤液，加0.1mT.0.3%H，混合均句。22
B.1pH7.4磷酸盐缓坤液(PLS)
B.1.1母液的配制
附录B
（规范性附录】
缓冲液的配制
B.1.1.1A液：准确称取NaHPO4·LO 27.6g,加水至1(00 nLB.1.1.2B液：准确称取NazHPO.-12HO28.4g,加水至1(00mLB.1.2缓冲液配制
取A液19mL，B液81ml,NaCl8.5区，加水至100mL，混合均句。B.2pH7.6Tris-HCI缓冲液
B.2.1母液的配制
B.2.1.1 A液:准确称取三烃中毕氨基甲烷(Tris)24.23,加水至1U00 mLB.2.1.2B液：准确吸取36%HC18.6mL,加水垒1000mLB.2.2缓冲液配制
取A液25mL，B液37.5mL，加水至1000mL，混合均匀SC/T 7201.2-2006
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