本标准规定了天然次生低产低效林改培的区划分类、培育目标、措施、调查设计、施工要求、检查验收、档案建立等技术要求。本标准适用于东北、内蒙古东部山地天然次生林改培,其他地区可参照执行。 LY/T 1898-2010 天然次生低产低效林改培技术规程 LY/T1898-2010 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS65.020.30
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1898—2010
畜禽线粒体DNA遗传多样性
检测技术规程
Protocol of detection for mitochondrial DNA genetic diversityofdomesticanimals
2010-07-08发布
2010-09-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准遵照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口。本标准起草单位：全国畜牧总站。本标准主要起草人：王志刚、刘丑生、邱小田、张桂香、韩旭、于福清、孙飞舟。NY/T1898—2010
1范围
畜禽线粒体DNA遗传多样性检测技术规程本标准规定了畜禽线粒体DNA遗传多样性检测的技术规程。本标准适用于畜禽线粒体DNA遗传多样性检测。2规范性引用文件
NY/T1898—2010
下列文件对于本文本的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GA/T383法庭科学DNA实验室检验规范NY/T1673畜禽微卫DNA遗传多样性检测技术规程3术语和定义
下列术语、定义和缩略语适用于本文件。3.1
mitochondrialDNA,mtDNA
线粒体DNA
动物细胞核外唯一具有半自主能力的双链环状DNA。3.2
线粒体DNAD-loop区
mt DNAD-loop
动物线粒体DNA翻译和转录的调控区和唯一的非编码区，当线粒体DNA开始复制时，此区外形呈D形。
4检测方法
4.1样品的采集和保存
4.1.1在中心产区采样，个体应具备该种群的典型特征，样品的采集及保存应满足提取DNA的要求，并详细记录材料名称、来源、系谱、采集时间、地点及保存条件。4.1.2每种群采集畜禽个体一般不少于60头（只），其中雄性数量不少于10%，要求个体间三代内无血缘关系。
4.2DNA的制备
制备DNA的方法按NY/T1673的规定执行。4.3引物制备
4.3.1引物合成
根据相关畜禽线粒体基因组序列设计引物，并合成。4.3.2工作液配制
将合成的引物瞬时离心，加入灭菌超纯水充分震荡，配成浓度为100pmol/L的储液，室温溶解30min，分装，一20C保存，储液稀释10倍即为工作液。其中加入灭菌超纯水的体积V(μL)按式(1)计算：V=33XOD×10%
NY/T1898—2010
式中：
MW——引物分子量；
ODDNA260nm吸收的光密度。
4.4PCR反应体系
PCR反应体系见附录A.1。
4.5PCR反应程序
PCR反应程序见附录A.2。
4.6扩增产物的检测与回收
凝胶电泳法检测PCR产物，扩增效果良好的样品按附录B纯化回收，按附录C测序。5数据分析
序列比对、单倍型统计、系统发生树构建等数据分析参见附录D。防污染措施
按GA/T383规定的方法执行。
7对照实验
设立阳性对照、阴性对照和空白对照，阳性对照为线粒体DNA样品，阴性对照为不具有细胞核DNA样品，空白对照为等量双蒸水。2
PCR反应体系见表A.1
组分及浓度
Buffer(10x)
MgCl, (25 mmol/ L)
引物P1A(10pmol/μL)
引物P1B(10pmol/μL)
dNTPs(10mmol/L)
Tag E(5 U/μL)
DNA样品
PCR反应程序见表A.2
预变性
25个~35个循环
附录A
(规范性附录）
PCR反应体系和程序
PCR反应体系
50ng~100ng
加至50
PCR反应程序
温度，℃
使用量
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20 s~60s
30 s~60s
30g~90 s
10min~70min
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B.1材料、试剂和仪器
B.1.1材料
待回收DNA样品。
B.1.2试剂
1%低熔点胶，琼脂糖：
附录B
（资料性附录）
扩增产物的纯化回收
glassmilkkit：裂解缓冲液，漂洗液，glassmilk；c)
TE,ddHO;
酚：分析纯；
氯仿：分析纯，
无水乙醇：分析纯；bZxz.net
70%乙醇：分析纯。
仪器设备
离心机；
水浴锅；
电泳仪。
B.2纯化回收程序
低熔点胶法
电泳到适当位置后，在目的DNA条带的前端挖一长方形槽，向槽中加入融化的低熔点胶，待凝固后进行电泳。当DNA进入低熔点胶中心时停止电泳。紫外灯下切下目的条带的低熔点胶。将切下的胶放到离心管中，加入200μL的TE，65℃温浴3min以融化低熔点胶。分别用酚/氯仿和氯仿抽提次。取上清液，加人2倍体积的无水乙醇，一20℃沉淀DNA2h以上，10000×g离心15min，弃上清液，用70%乙醇洗涤，吹干后溶于10μL无菌水中，取1μL电泳检测。B.2.2冻融法
电泳后直按切下凝胶中日的条带后加200μLTE，再加2倍体积酚，在液氮中冻2min，再65℃水浴中融化10min，这样重复数次，10000×g离心5min，取上相液加2倍体积100%冰乙醇一20℃沉淀过夜，离心回收DNA，70%乙醇洗一次后溶于适量的TE或无菌水中，电泳检测回收效果。B.2.3Classmilk法
0.8%琼脂糖凝胶电泳PCR产物，紫外灯下迅速切下目的条带，放入离心管，在含胶的离心管中加人3倍体积的凝胶裂解缓冲液混匀，60℃水浴5min，以融化凝胶，加人10μLglassmilk混匀，室温静置5min，10000×g离心1min弃上清液，加人125μL漂洗液，10000×g离心数秒钟，弃上清，再加人125μL漂洗液，如此反复两次，沉淀中加入适量无菌双蒸水混匀。60℃水浴5min，500Xg离心2min，回收上清，取10山电泳检测。
B结果分析
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DNA纯化回收后，电泳检测应为单一的条带。若电泳结果出现两条以上的带，则进行重复纯化回收。
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C.1PCR测序反应
附录C
（资料性附录）
DNA测序
C.1.1取0.2mL的PCR管，编号，将管插在颗粒冰中，按表C.1加样。表C.1测序反应体系
模板DNA(重组质粒)
DigDye 2. 0 premix
M13F/R通用引物
5x DigDye Reartinn Buffer
200ng~500ng
1.5gL~2.0μL
10pmol~30pmol
加至10μL
若用PCR扩增产物，需200bp~500bp10ng、500bp~1000bp20ng，引物为上游或下游单测引物。C.1.2将PCR管置于PCR仪上进行扩增。98℃变性2min后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃10s.50℃5s，60℃4min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。C.2醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物
将混合物离心，将扩增产物转移到1.5mL离心管中。加入25μL醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。10000×g于4℃离心30min，小心弃上清。加70%（V/V）的乙醇50μL洗涤沉淀2次。10000×g于4℃离心5min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10min15min。C.3电泳前测序PCR产物的处理
加入12μL的模板抑制试剂于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，瞬时离心。将溶液转移至盖体分离的0.2mLPCR管中，瞬时离心。在PCR仪上进行热变性（95℃2min），冰中骤冷，待上机。
C.4上机操作
安装毛细管，进行毛细管位置的校正，灌胶并建立运行的测序文件。仪器将自动灌胶至毛细管，1.2kV预电泳5min，按编程次序自动进样，再预电泳（1.2kV，20min），在7.5kV下电泳2h。电泳结束后；仪器会自动清洗、灌胶、进下一样品、预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后，仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。5进行序列分析、序列比较。
D.1序列比对
附录D
(资料性附录）
数据分析
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所得序列首先用序列比对软件进行完全比对，特别是出现碱基缺失或插人的区域，需要人为校对以达到最大的序列相似性。
2序列变异性分析及单倍型的识别利用序列变异分析软件确定多态位点，计算碱基组成、转换/颠换比率（Ts/T>）。缺失/插人的位点在统计时删除。
D.3单倍型、单倍型频率
在单倍型统计软件中识别单倍型，并计算单倍型频率。D.4核苷酸多样性、单倍型多样性用核苷酸多样性、单倍型多样性软件计算核苷酸多样性、单倍型多样性（haplotypicdiversity)等多态性统计参数，
5系统发生树的构建
在系统发生树构建的软件中基于Kimura-2参数核苷酸替代模型，构建Neighbour-joining(NJ)系统发生树，计算单倍型间的遗传距离。D.6网络分析
使用media-joiningnetwork网络进一步分析不同单倍型间的进化关系。D.7核苷酸不配对分析和选择中性检验采用核苗酸不配对分析(mismatchanalysis）和Fu's中性检验两种方法分析检验群体在过去是否发生扩张或经受了瓶颈效应。
NY/T1898-2010
中华人民共和国
农业行业标准
畜禽线粒体DNA遗传多样性检测技术规程NY/T18982010
中国农业出版社出版
(北京市朝阳区麦子店街18号楼）（邮政编码：100125
网址：www.ceap.com.cn)
北京昌平环球印刷厂印刷
新华书店北京发行所发行
各地新华书店经销
开本880mm×1230mm1/16
2010年7月第1版
印张0.75
字数7千字
2010年7月北京第1次印刷
书号：16109·2123
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