标准号：GB/T 38579-2020
标准名称：生物产品中光合细菌测定
英文名称：Determination of photosynthetic bacteria in biologic products
标准格式：PDF
发布时间：2020-03-31
实施时间：2020-03-31
标准大小：6.59M
标准介绍：范围
本标准规定了生物产品中光合细菌的测定方法。
本标准适用于生物产品中深红红螺菌( Rhodos pirillum rubrun)、黄褐红螺菌( Rhodos pirillum fulvum)、沼泽红假单胞菌( Rhodo pseudomonas palustris)、荚膜红细菌( Rhodobacter capsulatus)和球形红细菌( Rhodobacter sphaeroides)的测定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
本标准规定了生物产品中光合细菌的测定方法。 本标准适用于生物产品中深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、黄褐红螺菌(Rhodospirillum fulvum)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)和球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的测定。

ICS07.080
iiiKAa~cJouakAa
中华人民共和国国家标准
GB/T38579—2020
生物产品中光合细菌测定
Determination of photosyntheticbacteriain biologicproducts2020-03-31发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-03-31实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中国标准化研究院提出并归口。iiiKA~cJouakAa
GB/T38579-—2020
本标准起草单位：湖南农业大学、中国标准化研究院、江汉大学、北京工商大学、武汉明了生物科技有限公司、北京萨姆伯科技有限公司本标准主要起草人：周辉、马爱进、彭海、贾英民、田云、郝帅。1
1范围
生物产品中光合细菌测定
本标准规定了生物产品中光合细菌的测定方法iiiKA~cJouakAs
GB/T38579-—2020
本标准适用于生物产品中深红红螺菌（Rhodospirillumrubrum）、黄褐红螺菌（Rhodospirillumfuluum）、沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonaspalustris）、英膜红细菌（Rhodobactercapsulatus）和球形红细菌（Rhodobactersphaeroides）的测定。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法GB/T6682
术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
biologicproducts
生物产品
利用生物技术获得的产品。
注：本标准中的生物产品特指含光合细菌的产品。3.2
光合细菌
photosyntheticbacteria
具有原始光能合成体系的原核生物·能在厌氧条件下进行不放氧光合作用细菌的总称。注：专指不产氧光合细苗，尤其是紫色非硫细菌类，属于变形菌门（Proteobacteria）a-变形菌纲（Alphaproteobacteria）螺菌目（Rhodospirillales）、根瘤菌日（Rhizobiales）、红杆菌目（Rhodobacterales），包括深红红螺菌、黄褐红螺菌、沼泽红假单胞菌、英膜红细菌和球形红细菌等。3.3
多核苷酸多态性
multiplenucleotidepolymorphism;MNP一段核苷酸区域内多个核苷酸引起的序列多态性。4原理
将待分离的样品进行稀释后·接种于选择性培养基中，由单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落。根据平板的菌落数及挑取菌落的生理生化、MNP鉴定结果，对生物产品中的光合细菌进行计数试剂或材料
本方法所用试剂均为分析纯，除特殊说明外，实验用水均为GB/T6882规定的级水1
GB/T38579—2020
AT培养基：参见附录A中A.1。
光合细菌分离琼脂：参见A.2。
磷酸盐缓冲液：参见A.3。
革兰氏染色液：参见A.4。
多重PCR扩增与文库构建试剂盒。高通量测序试剂盒。
引物：见附录B。
仪器设备
光照恒温培养箱：照度不小于20001x，30℃±1℃2天平：精度为0.001g。
高通量测序仪。
抽滤瓶
均质器、无菌均质袋、均质杯。水相滤膜：微孔径0.22μm。
微需氧培养罐：能维持1%氧浓度的透明培养容器装置。无菌锥形瓶：容量250ml、500ml螺口试管：容量13ml。
无菌培养皿：直径90mm。
显微镜：最低100×。
7样品
采样原则
iiKA-cJouakAs
样品的采集应遵循随机性、代表性的原则。采样过程应遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。
采样方法
应在同一批次产品中采集样品，每件样品的采集量应满足微生物指标检验的要求，一般不少于7.2.1
500g(ml)。
7.2.2独立包装不大于500g的固体产品或不大于500ml的液态产品，取完整包装7.2.3独立包装大于500mL的液态产品，应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体，使其达到均匀后采集适量样品，放人无菌采样容器内作为一件样品7.2.4独立包装大于500g的固体产品，应用无菌采样器从同一包装的不同部位分别采取适量样品，放人同一个无菌采样容器内作为一件样品。7.3
采集样品的贮存和运输
应尽快将样品运往实验室检验。应在运输过程中保持样品完整。应在接近原有贮存温度条件下贮存样品，或采取必要措施防止样品中微生物数量的变化8试验步骤
8.1样品的稀释
TiiKA-cJouakAs
GB/T38579—2020
8.1.1固体样品：称取25g样品置于盛有225ml磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8.000r/min~10000r/min均质1min~2min，或放入盛有225ml.稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min，制成1：10的样品匀液。8.1.2液体样品：取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。8.1.3取1：10样品匀液1ml..沿管壁缓慢注人盛有9ml.磷酸缓冲液的无菌试管中.振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100样品匀液。依次稀释，制备10倍系列稀释样品匀液。
8.1.4将15ml~20mL光合细菌分离琼脂培养基倾注平血，待培养基冷却凝固后，根据对样品中光合细菌数量的估计，选择8.1.3中2个～3个连续的适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），每个稀释度接种2个无菌平皿，准确吸取1ml均匀涂布于分离培养基上。8.1.5待8.1.4中接种物完全被培养基吸收后，将5mL~10ml.冷却至46℃以下的光合细菌分离琼脂培养基倒入平血中，并转动平血使其完全覆盖住下层的培养基。8.2培养
待琼脂凝固后，将平皿翻转置于微需氧培养罐中30℃土1℃光照培养5d。8.3菌落计数
8.3.1可用肉眼观察，记录稀释倍数和相应的棕红色菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colonyformingunits.cFU)表示。
8.3.2选取菌落数在30300之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数8.3.3其中一个平板有较大片状菌落生长时，不宜采用，应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数：若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
8.3.4当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时.将每条单链作为一个菌落计数8.4光合细菌的鉴定
8.4.1菌落挑选和纯培养
挑取计数平板上5个（小于5个全选）菌落大、红色、棕色或黄色、表面光滑、质地柔软、边缘整齐的菌落分别接种于光合细菌分离琼脂平板，置微需氧培养罐中，30℃土1℃光照培养2d～3d。8.4.2MNP法鉴定
8.4.2.1DNA提取
提取纯培养中单菌落基因组DNA，将其进行纯化。提取与纯化的DNA溶液在260nm与230nm处的吸光度值的比值大于2.0：在260nm与280nm处的吸光度值的比值介于1.7与1.9之间：DNA电泳主带明显，无明显降解；无明显RNA残留。3
GB/T38579—2020
多重PCR扩增与文库构建
iiKA-cJouakAs
按多重PCR扩增与文库构建试剂盒的说明书进行DNA质控、多重PCR扩增、文库构建与纯化，且多重PCR的扩增循环数不高于20个。8.4.2.3
高通量测序
按高通量测序试剂盒和高通量测序仪的操作说明进行高通量测序与测序质控。高通量测序的平均覆盖倍数设置为700倍以上，测序长度大于标记引物在参考基因组上的扩增长度。
8.4.2.4实验数据质量控制
利用光合细菌鉴定软件将样品的测序数据比对到参考基因组的标记位点上，统计标记位点的平均覆盖倍数Cre
当C<500时，判定样品的测序数据量不足，从8.4.2.2或之前的步骤开始重新实验。当C≥500时，判定测序数据合格。8.4.2.5结果判定
利用光合细菌鉴定软件统计光合细菌的检出标记的数目N，并输出判定结论。若N一0，判定结论为“待测菌落不存在该光合细菌”若N=1或N=2判定结论为\待测菌落中可能存在该光合细菌”。若≥3，判定结论为”得测菌落中存在该光合细菌”。对于判定结论为“得测菌落中可能存在该光合细菌”的样品。8.4.2.6
防污染措施
样品准备、核酸提取、多重PCR扩增与高通量测序应在规定的区域内进行操作且保持实验室通风良好。不同区域的仪器和设备应专用。8.4.3形态学鉴定
挑取纯培养物，进行染色镜检，紫色非硫细菌形态特征见附录C中的C.1。8.4.4碳源利用试验
将纯培养物分别接种于含有不同碳源的AT培养基中.30℃士1℃光照培养3d～5d。紫色非硫细菌中代表属种的生理生化鉴定特征见附录C。8.5试验数据处理
8.5.1菌落的计算方法
每个平板中光合细菌菌落的计算见式（1)：b
式中：
每块平板上的光合细菌菌落数：a
b挑取后经证实为光合细菌的菌落数：A—挑取平板上用于验证的菌落数：4
....(1)
C平板上的所有特征菌落数。
8.5.2菌落总数的计算方法
iiiKA-cJouakAs
GB/T38579-—2020
8.5.2.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值.再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（毫升）样品中菌落总数结果：8.5.2.2
若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（2）计算：EC
［(n+0.1n)d]
式中：
样品中某一种光合细菌的活菌数；平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和：第一稀释度（低稀释倍数）平板个数：第二稀释度（高稀释倍数）平板个数：稀释因子（第一稀释度）。
.........
·（2)
若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU应对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU.应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数8.5.2.4
计算。
若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，以小于1乘以最低稀释倍数计算。8.5.2.5
若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间.其中一部分小于30CFU或大于8.5.2.6
300CFU时，以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。8.6
菌落总数报告
8.6.1若N为0.则以小于1乘以最低稀释倍数报告。8.6.2菌落数小于100CFU时，按”四舍五入”原则修约，以整数报告。8.6.3菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五人”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数：也可用10的指数形式来表示，按“四舍五人“原则修药后，采用两位有效数字8.6.4若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，报告菌落蔓延8.6.5若空白对照上有菌落生长，此次检测结果无效8.6.6称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。5
GB/T38579—2020
AT培养基
基础培养基
MgCl·6H,O
CaCl.·2H.0
蒸馏水
微量元素添加液
FeCl.4H,0
CoCla·6H,0
NiCl:6H,0
CuClg5Ho
MnCl·4H,O
NagMo0.·2H.
Na.SeO,.5H0
（资料性附录）
培养基
10mmol/L
1000mL
上述成分分别溶解到约900mL水中.用1mol/L盐酸调节pH为2~3.定容至1L。A.1.3
维生素添加液
对-氨基苯甲酸
生物素
蒸馏水
iiiKAicJouakA
经0.22um水相滤膜过滤，保存在无菌容器中，冷藏保存A.1.4
总局化共督管理
抗坏血酸
蒸馏水
经0.22um水相滤膜过滤，保存在无菌容器中，冷藏避光保存。A.1.5
AT国家准标和
iiiKAa~cJouakAa
GB/T38579-—2020
临用前，1000mLA.1.1基础培养基添加1ml.微量元素添加液、1ml.维生素添加液和10mL抗坏血酸添加液，调节pH6.9士0.1.培养基经0.22um水相滤膜过滤，分装到13mlL灭菌螺口试管中，每管装液12mL。
中华人民监委员会
淮市国家准
CHCOONa·3H,O
酵母膏
K,HPO,·3H,0
MgCl,·6H,0
Fe-EDTA溶液
琼脂粉
蒸馏水
乙二胺四乙共铁钠溶理
FeSO.·7H.0
Na-EDTA
蒸馏水
淮市国家准标和
1000ml
除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中.pH6.9.加入琼脂，加热溶解.定量分装适宜容器，121℃高压火菌15min
GB/T38579—2020
光合细菌分离琼脂制法
TiiKA~cJouakAa
临中前定测础细菌测融准，保温化46℃生浴.1000mL测础细菌测标加人5mL抗坏血进添加二。摇勾合备中。
磷酸盐缓冲稀释液
贮存液
外进说氢钾
蒸馏生
A.3.1.2制法
中的约175ul1mol/L氢物准钾溶二调节pH至7.2.中蒸馏生品光至1000ml.合贮存化冰箱标。
稀释液
中蒸馏生品光1.25ml.贮存二至1000ml，了装化由宜容器标，121℃高压灭起15min。A.4
革兰氏染色法
结晶紫染色液
方晶有
95%乙醇
1%本进铵生溶二
2制法
定方晶有完全溶解化乙醇标，然合级本进铵溶二混规。A.4.2
革兰氏碘液
碘准钾
蒸馏生
A.4.2.2制法
定碘级碘准钾先技混规，加人蒸馏生明许充了振摇，产完全溶解合·再加蒸馏生至300mL.A.4.3
复染液
A.4.3.1成分
95%乙醇
蒸馏水
A.4.3.2和品
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.4.4
原仪品
将涂片在火焰上固定.滴加结晶紫染色液，染色1min，水洗、A.4.4.2
滴加革兰氏碘液.作用1min水洗。iiiKA~cJouaKA
GB/T38579-—2020
滴加95%乙醇脱色，约30s，水洗；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s。
水洗，滴加沙黄复染液，复染1min，水洗，待干，镜检结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色9
GB/T38579—2020
MNP准记有的光表B.1。
并单提位照大化
并单提位照大化
并单提位照大化
并单提位照大化
并单提位照大化
并单提位照大化
并单提位照大化
并单提位照大化
并单提位照大化
并单提位照大化
并单提位照大化
明生提中化
明生提中化
明生提中化
准记出点编号
（规范性附录）
MNP标记引物
MNP标记引物
有的进别
正向有的
反向有的
正向有的
反向有的
正向有的
反向有的
正向有的
反向有的
正向有的
反向有的
正向有的
反向有的
正向有的
反向有的
正向有的
反向有的
正向有的
反向有的
正向有的
反向有的
正向有的
反向有的
正向有的
反向有的
正向有的
反向有的
正向有的
反向有的
有的品物（5-3端）
TiiKA~cJouakAa
GATGGGCGTCAAGGTCGA
ACCGGCTTCGGCATGAA
ATCAAGATCAACCACGAGACCCA
GAGACGTGGATCAGGCCTTC
CGGGTGCTGATGATGCTGT
ACGCCGTCGGTGCTTAAA
TCTTGCCGACCACGATCG
CGACCGAAGTCGAGGTCAAG
GGCGAAATCGTCGCCTG
GAGCACGCTTTGGACGAAC
ATCAACGCCTTCACCAACCC
CGGACCCGGATCGATCTTG
GGCACGCTGTTCACCTTC
CTTGATGTCGCCCTTGGCbZxz.net
TAACGGCTGGCATTCATCGTTTA
TGATACTGGAAGTCTTGAGTATGGCA
CCTGCTCGTCGGTCTTCATG
CGGTTGAACTCGCAGCTGAT
AAGTGGTGCTGGTCGGC
CGAGAACACCTGGCTCTTCTTG
CGGCACTTCCATGCCGA
GTCAACTTCGAAGAGCCGC
GGGAAATTGGAATGGGCGAAGAT
GGTCGATCAGCGTGCTGAA
GGAAGCGCGTCTGTTCAAATAC
TCGATGACCTTCCAGTTGATGAATTC
ATGCGGGAACGCGCAGATA
ATGGTCGGAGCGAGAGGAT
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