GB/T 39101-2020.Determination of antimicrobial activity for polypeptides-Inhibition zone method.
1范围
GB/T 39101规定了多肽抗菌性的抑菌圈测定方法。
GB/T 39101适用于多肽抗细菌性能和抗丝状真菌性能的测定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 4789.2食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
多肽 polypeptides
介于氨基酸和蛋白质之间,由2个或2个以上氨基酸通过肽键连接形成的一类化合物。
3.2
抑菌圈 inhibition zone
固体培养基表面与试样接触边界处无菌繁殖的环带区域。
3.3
抗菌性 antimicrobial activity
抑制微生物繁殖的能力，以抑菌效价U值(AU)来表示。
4原理
利用多肽在固体平板中与测试指示菌接触后,使其周围的菌株生长受到抑制,形成无菌繁殖区域，根据测试菌在固体平板表面表现出的抑菌圈直径,计算抑菌效价U值来判定活性。
5试剂或材料
除非另有说明,本方法所用的试剂均为分析纯,实验用水为GB/T 6682规定的一级水。
5.1生理盐水
0.85%生理盐水:称取8.5 g氯化钠于容量瓶中,用一级水溶解并定容至1 000 mL。121 °C士1 °C高压蒸汽灭菌20 min。
5.2培养基
营养肉汤培养基(NB)、营养琼脂培养基(NA)、马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(PDA),配制参见附录A。
本标准规定了多肽抗菌性的抑菌圈测定方法。 本标准适用于多肽抗细菌性能和抗丝状真菌性能的测定。

ICS07.080
中华人民共和国国家标准
GB/T39101—2020
多肽抗菌性测定
抑菌圈法
Determination of antimicrobial activity for polypeptides-Inhibition zone method2020-09-29发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-04-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387)提出并归口。GB/T39101—2020
本标准起草单位：北京工商大学、河北科技大学、深圳市计量质量检测研究院、河北农业大学、北京萨姆伯科技有限公司、武汉明了生物科技有限公司、浙江东杰生物科技有限责任公司、市场监督管理总局食品审评中心、中国测试技术研究院生物研究所。本标准主要起草人：贾英民、马爱进、干志新、田益玲、郝帅、彭海、周李华、杨志坚、郑燕燕、郑刚、陈晶、姜雨、杨国武。
1范围
多肽抗菌性测定
本标准规定了多肽抗菌性的抑菌圈测定方法抑菌圈法
本标准适用干多肽抗细菌性能和抗丝状真菌性能的测定。规范性引用文件
GB/T39101—2020
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB4789.2食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
polypeptides
介于氨基酸和蛋白质之间，由2个或2个以上氨基酸通过肽键连接形成的一类化合物，3.2
抑菌圈inhibition zone
固体培养基表面与试样接触边界处无菌繁殖的环带区域3.3
antimicrobial activity
抗菌性
抑制微生物繁殖的能力，以抑菌效价U值（AU)来表示。原理此内容来自标准下载网
利用多肽在固体平板中与测试指示菌接触后，使其周围的菌株生长受到抑制，形成无菌繁殖区域，根据测试菌在固体平板表面表现出的抑菌圈直径，计算抑菌效价U值来判定活性。试剂或材料
除非另有说明，本方法所用的试剂均为分析纯，实验用水为GB/T6682规定的一级水。生理盐水
0.85%牛理盐水：称取8.5g氯化钠于容量瓶中，用一级水溶解并定容至1000mL。121℃土1℃高蒸汽灭菌20min。
GB/T39101—2020
培养基
营养肉汤培养基（NB）、营养琼脂培养基（NA）、马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（PDA），配制参见附录A。
5.3指示菌标准菌株
革兰氏阳性细菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）CICC10473（CGMCC1.8721、ATCC29213），藤黄微球菌（Micrococcusluteus)CICC10269（CGMCC1.3749、ATCC10240），蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus)CICC10277(CICC10468、ATCC11778）。革兰氏阴性细菌：大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）CICC10305（CICC23657、CGMCC1.2385、ATCC25922）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）CICC22956（ATCC14028）、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)CICC10351(CICC23694CGMCC1.2421、ATCC9027)。丝状真菌：黑曲霉（Aspergillusniger)CICC2463（CGMCC3.5487、CICC40372、ATCC16404），产黄青霉（Penicilliumchrysogenum）CICC40654（CGMCC3.7894、ATCC10106），桔青霉（Penicilliumcitrinum)CICC2478(ATCC9849)。6仪器设备
恒温培养箱：温度精度1℃。
电子天平：感量为0.0001g和0.01g。6.3分光光度计：波长范围为190nm~900nm。6.4
游标卡尺或抑菌圈测量仪：精度0.02mm~0.1mm。6.5血球计数板：16格×25格或25格×16格。6.6
玻璃平血：直径为90mm，底部平整。6.7
不锈钢牛津杯：内径6.0mm±0.1mm、外径7.8mm±0.1mm、高10.0mm±0.1mm7试验步骤
抗细菌性能测定
样品制备
称取多肽样品10.0mg，水溶性好的样品采用无菌缓冲液溶解与定容，水溶性差的样品先溶于无水乙醇再用无菌缓冲液定容至1.0mL，使其浓度为10.0mg/mL，作为储备液，4℃～6℃冰箱中保存，应在一周内使用。使用时，采用无菌缓冲液将多肽储备液进行稀释，制备成至少5个不同浓度的待测溶液，浓度的选择应使抑菌圈直径8.00mm~25.00mm，且线性方程R2≥0.9900。7.1.2指示菌悬液制备
7.1.2.1菌种活化
将指示菌接种于5.0mLNB培养基的试管，36℃士1℃、200r/min士1r/min培养18h~24h进行第一次传代培养；取第一代培养液接种于5.0mLNB培养基的试管，36℃士1℃、200r/min士1r/min培养18h～24h进行第二次传代培养；取第二代培养液接种于5.0mLNB培养基的试管或50.0mLNB培养基的锥形瓶，36℃土1℃、200r/min士1r/min培养至指示菌的稳定期，作为第三代培养液。2
7.1.2.2菌悬液制备
GB/T39101—2020
预先按照GB4789.2进行指示菌的菌落计数，建立.菌落数与吸光度值（ODoo）的对应关系；将第三代培养液调整至合适的吸光度值，使其菌悬液浓度为1×10°CFU/mL5×10°CFU/mL。7.1.3检测平板制备
将配制的NA培养基加热溶解，冷却至45℃～50℃，将制备的指示菌菌悬液按照1%的添加量加入NA培养基中，充分混合均匀，量取20mL倾倒人灭菌平皿，轻轻摇动平皿使之均匀铺平，待其凝固后备用。
7.1.4测定
在含有指示菌的检测平板中等距离安放5个～6个牛津杯，轻轻按压，量取多肽样品100μL，缓缓加人牛津杯中，每个处理重复3次。将平板移人4℃～6℃冰箱中预扩散4h～10h，取出平板，放人36℃土1℃恒温培养箱中，正置培养至抑菌圈清晰，采用游标卡尺或抑菌圈测量仪测定抑菌圈直径，每个抑菌圈沿不同方向测量3次，并记录平均值。以多肽稀释倍数倒数的对数值为横坐标，以抑菌圈直径为纵坐标，建立线性方程（R\≥0.9900)。杆菌肽对S.aureusATCC25923的线性关系图参见附录B的图B.1。7.2抗丝状真菌性能测定
7.2.1样品制备
同7.1.1。
7.2.2指示菌孢子悬液制备
7.2.2.1菌种活化
将指示菌子或菌悬液接种于PDA培养基的固体平板上，29℃士1℃恒温培养48h～72h，作为第一代孢子培养物；取第一代孢子培养物接种于PDA培养基的固体平板上，29℃土1℃恒温培养48h～72h，作为第二代孢子培养物；取第二代孢子培养物接种于PDA培养基的固体平板上,29℃土1℃恒温培养48h～72h，作为第三代孢子培养物。7.2.2.2孢子悬液制备
将第三代孢子培养物用0.85%生理盐水洗脱孢子，血球计数板计数，将孢子浓度调整至1×10°CFU/mL~5×10°CFU/mL。
7.2.3检测平板制备
将配制的PDA培养基加热溶解，冷却至45℃～50℃，将制备的指示菌孢子悬液按照1%的添加量加人PDA培养基中，充分混合均匀，量取20mL倾倒人灭菌平，轻轻摇动平板使之均匀铺平，待其凝固后备用。
7.2.4测定
在含有指示菌的检测平板中等距离安放5个～6个牛津杯，轻轻按压，量取多肽样品100μL，缓缓加人牛津杯中，每个处理重复3次。将平板移人4℃～6℃冰箱中预扩散4h～10h，取出平板，放人29℃土1℃恒温培养箱中，正置培养18h～24h至抑菌圈清晰，此时指示菌为菌苔状，基本还未形成菌3
GB/T39101—2020
丝；采用游标卡尺或抑菌圈测量仪测定抑菌圈直径，每个抑菌圈沿不同方向测量3次，并记录平均值。以多肽稀释倍数倒数的对数值为横坐标，以抑菌圈直径为纵坐标，建立线性方程（R2≥0.9900)。硫酸多粘菌素B对A.nigerATCC16404的线性关系图参见图B.2。8
试验数据处理
抗菌性按式(1)计算：
V×10x×c
式中：
U——抗菌效价，单位为AU每毫克（AU/mg）；V—一样品的测定体积，单位为毫升（mL)；X。—一线性方程的X轴截距；
样品的初始测定浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）。计算结果以3次平行测定值的算术平均值表示，保留两位有效数字。4
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A.1营养肉汤培养基（NutrientBroth，NB）附录A
（资料性附录）
培养基
GB/T39101—2020
A.1.1将蛋白陈10g、牛肉膏3g、氯化钠5g放入1000mL一级水中，煮沸溶解，调节pH值至7.2~7.4,分装后于高压蒸汽灭菌器中，121℃士1℃灭菌20min。2可采用市售的商业培养基，使用时严格遵照制造商的使用说明。A.1.2
A.2营养琼脂培养基（NutrientAgar，NA）A.2.1将蛋白陈10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g放1000mL一级水中，煮沸溶解，调节pH值至7.2～7.4，分装后干高压蒸汽灭菌器中，121℃±1℃灭菌20min。可采用市售的商业培养基，使用时严格遵照制造商的使用说明。A.2.2
3马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（PotatoDextroseAgar，PDA）A.3
A.3.1将去皮切块马铃薯200g放人1000mL一级水中，煮沸10min～20min，用纱布过滤，补加级水至1000mL。加人葡萄糖20g、琼脂15g，加热溶化，调节pH值至5.4~5.8，115℃土1℃灭菌20 min。
可采用市售的商业培养基，使用时严格遵照制造商的使用说明。SAG
GB/T39101—2020
抗细菌性能测定
附录B
（资料性附录）
抗菌性测定线性关系图
杆菌肽对S.aureus
杆菌肽二倍梯度稀释5个浓度，浓度范围为0.0625mg/mL～2.0mg/mL。2ATCC25923的线性关系图见图B.1。26
·试验一
试验二
试验三
-1.6-1.4 -1.2-1.00.80.6-0.4 -0.20.00.2Ig(1/n)）
杆菌肽对s.aureusATCc25923的线性关系图图B.1
2抗丝状真菌性能测定
硫酸多粘菌素B二倍梯度稀释5个浓度，浓度范用为0.125mg/mL~4.0mg/mL。硫酸多粘菌素B对A.nigerATCC16404的线性关系图见图B.2。22
·试验
·试验二
试验三
1.6-1.4-1.2-1.00.80.60.40.20.0°0.2lg(1/n)
硫酸多粘菌素B对A.nigerATCC16404的线性关系图
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