备案号：2744-1999 中华人民共和国行业标准 SB/T 10317-1999 蛋白酶活力测定法 Measure of proteinase activity 本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白活力测定。 1 福林法 1.1 试剂及溶液 以下试剂都为分析纯。 1.1.1 福林试剂（Folin试剂）：于2000mL三口回流装置内加入钨酸钠（Na₂WO₄·2H₂O）100g、钼酸钠（Na₂MoO₄·2H₂O）25g、蒸馏水700mL、5%磷酸50mL、浓盐酸100mL，文火回流10h。取下冷凝器，加入硫酸锂（Li₂SO₄）50g、蒸馏水50mL，混合均匀，加入几滴焦性没食子酸，再煮沸15min，以驱除残留物及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍呈蓝色，需再加几滴焦性没食子酸，再煮沸除去之。冷却后，定容至1000mL，用细菌漏斗（No.4~5）过滤，置于棕色瓶中保存。此试剂浓液用时加2倍蒸馏水稀释，即成已稀释的福林试剂。 1.1.2 0.4mol/L碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠（Na₂CO₃）42.4g，定容至1000mL。 1.1.3 0.4mol/L三氯乙酸（TCA）溶液：称取三氯乙酸（CCl₃COOH）63.4g，定容至1000mL。 1.1.4 pH 7.2磷酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·2H₂O）31.2g，定容至1000mL，即成0.2mol/L溶液（A液）；称取磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）71.63g，定容至1000mL，即成0.2mol/L溶液（B液）。取A液28mL和B液72mL，再用蒸馏水稀释1倍，即成0.1mol/L pH 7.2的磷酸盐缓冲液。 1.1.5 2%酪蛋白溶液：准确称取干酪素2.000g（准至0.002g），加入0.1mol/L氢氧化钠10mL，在水浴中加热使溶解（必要时用小火加热促进溶解），然后用pH 7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。 1.1.6 100μg/mL酪氨酸溶液：精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g，逐步加入6mL 1mol/L盐酸使其溶解，用0.2N盐酸定容至100mL，其浓度为1000μg/mL。再吸取此液10mL，以0.2N盐酸定容至100mL，即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。 1.2 仪器 a. 分析天平，感量0.1mg b. 581-G型光电比色计或72型分光光度计 c. 水浴锅 d. 1、2、5、100mL移液管等 1.3 操作 1.3.1 标准曲线的绘制 1.3.1.1 按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液（表1）。 表1 配制各种不同浓度的酪氨酸溶液 编号 | 蒸馏水(mL) | 100μg/mL酪氨酸(mL) | 酪氨酸最终浓度(μg/mL) ---|---|---|--- 1 | 10 | 0 | 0 2 | 9 | 1 | 10 3 | 8 | 2 | 20 4 | 7 | 3 | 30 5 | 6 | 4 | 40 6 | 0 | 10 | 100 1.3.1.2 测定步骤：取6支试管，编号，按表1分别吸取不同浓度酪氨酸溶液1mL；各加入0.4mol/L碳酸钠5mL，再各加入已稀释的福林试剂1mL，摇匀置于水浴锅中，40℃保温发色20min。在581-G型光电比色计上分别测定光密度（OD）（滤色片用650nm）或用72型分光光度计进行测定（波长660nm）。每管测三次，取平均值。将2-6号管所测得的光密度（OD）减去1号管（蒸馏水空白试验）所测得的光密度为净OD值。 为了清楚起见，再列出表格如下（表2）。 表2 标准曲线测定记录 编号 | 按表1制备的不同浓度酪氨酸(mL) | 0.4mol/L Na₂CO₃(mL) | 福林试剂(mL) | OD值1 | OD值2 | OD值3 | 平均OD值 | 净OD值 ---|---|---|---|---|---|---|---|--- 1 | 0 | 5 | 1 | - | - | - | - | - 2 | 1 | 5 | 1 | - | - | - | - | - 3 | 2 | 5 | 1 | - | - | - | - | - 4 | 3 | 5 | 1 | - | - | - | - | - 5 | 4 | 5 | 1 | - | - | - | - | - 6 | 10 | 5 | 1 | - | - | - | - | - 以净OD值为横坐标，酪氨酸的浓度为纵坐标，绘制成标准曲线（或可求出每单位OD值所相当的酪氨酸量K）。 1.3.2 样品稀释液的制备 1.3.2.1 测定酶制剂：称取酶粉0.100g，加入pH 7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL，吸取此液5mL，再用缓冲液稀释至25mL，即成5000倍的酶粉稀释液。 1.3.2.2 测定成曲：称取充分研细的成曲5g，加水至100mL，在40℃水浴内间断搅拌1h；过滤，滤液用0.1mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液稀释到一定倍数（估计酶活力而定）。 1.3.3 样品测定：取15×100mm试管3支，编号1、2、3（做2只也可）；每管内加入样品稀释液1mL，置于40℃水浴中预热2min，再各加入经同样预热的酪蛋白1mL，精确保温10min。时间到后，立即再各加入0.4mol/L三氯乙酸2mL，以终止反应。继续置于水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀。离心或过滤，然后吸取15×150mm试管3支，编号1、2、3，每管内加入滤液1mL，再加0.4mol/L碳酸钠5mL，已稀释的福林试剂1mL，摇匀，40℃保温发色20min后进行光密度（OD）测定。 空白试验也取试管3支，编号（1）、（2）、（3），测定方法同上，只是在加酪蛋白之前先加0.4mol/L三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入酪蛋白。 为了清楚起见，分别列出表格如下（见表3及表4）。 表3 样品测定记录 编号 | 预热酶液(mL) | 预热2%酪蛋白(mL) | 作用10min(精确计时) | 0.4mol/L三氯乙酸(mL) | 滤液(mL) | 0.4mol/L Na₂CO₃(mL) | 福林试剂(mL) | OD值1 | OD值2 | OD值3 | 平均OD值 | 净OD值 ---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|--- 1 | 1 | 1 | 10min | 2 | 1 | 5 | 1 | - | - | - | - | - 2 | 1 | 1 | 10min | 2 | 1 | 5 | 1 | - | - | - | - | - 3 | 1 | 1 | 10min | 2 | 1 | 5 | 1 | - | - | - | - | - 表4 空白试验记录 编号 | 预热酶液(mL) | 0.4mol/L三氯乙酸(mL) | 作用10min(精确计时) | 预热2%酪蛋白(mL) | 滤液(mL) | 0.4mol/L Na₂CO₃(mL) | 福林试剂(mL) | OD值1 | OD值2 | OD值3 | 平均OD值 ---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|--- (1) | 1 | 2 | 10min | 1 | 1 | 5 | 1 | - | - | - | - (2) | 1 | 2 | 10min | 1 | 1 | 5 | 1 | - | - | - | - (3) | 1 | 2 | 10min | 1 | 1 | 5 | 1 | - | - | - | - 样品的平均光密度（OD）- 空白的平均光密度（OD）= 净OD值。 1.4 计算 在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为1个蛋白酶活力单位。 样品蛋白酶活力单位（干基） = [(样品平均OD - 空白平均OD) × K] × N × d / (10 × W) 式中： A - 由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数（或OD值×K）； d - 取1mL反应液测定（即1倍）； N - 酶液稀释的倍数； W - 样品水分百分含量。 1.5 注意事项 以上介绍的方法用于测定中性蛋白酶（pH 7.2）。若要测定酸性蛋白酶或碱性蛋白酶，则把配制酪蛋白溶液和测定时用的pH缓冲液换成相应pH缓冲液即可。现把几种常用pH缓冲液配方提供如下： 1.5.1 pH 7.5磷酸盐缓冲液(0.02mol/L)：称取磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）5g，以蒸馏水溶解定容至1000mL。 1.5.2 pH 4.5乳酸-乳酸钠缓冲液(0.05mol/L)： A液：称取80%~90%乳酸13.5g，加蒸馏水稀释定容至1000mL。 B液：称取70%乳酸钠16g，用蒸馏水稀释定容至1000mL。 取A液16mL与B液14mL混合，用蒸馏水稀释至适当体积即成。 1.5.3 pH 3.0乳酸-乳酸钠缓冲液(0.05mol/L)： A液：称取80%~90%乳酸11.5g，以蒸馏水定容至1000mL。 B液：称取70%乳酸钠16g，用蒸馏水溶解定容至1000mL。 取A液5mL与B液15mL混合，用蒸馏水稀释至适当体积即成。 1.5.4 pH 10.0硼砂-氢氧化钠缓冲液： A液：称取硼砂19.8g，用蒸馏水溶解定容至1000mL（0.1mol/L）。 B液：称取氢氧化钠8g，用蒸馏水溶解定容至1000mL（0.2N）。 取A液250mL + B液215mL混合，用蒸馏水稀释定容至1000mL即成。 1.5.5 pH 11.0硼砂-氢氧化钠缓冲液： A液：称取硼砂19.8g，用蒸馏水定容至1000mL。 B液：称取氢氧化钠4g，用蒸馏水定容至1000mL。 取A液与B液等量混合。 1.5.6 2%酪蛋白溶液配制酸性时，需先加数滴浓乳酸，使之湿润以加速其溶解。 2 甲醛法 成曲蛋白酶活力的测定，如用福林法测定确有困难时，可用甲醛法测定作参考。 2.1 仪器 a. 分析天平，感量0.01g b. 水浴锅 c. 电烘箱 d. 容量瓶、吸管、滴定管等 2.2 试剂与溶液 a. 1%酚酞指示剂； b. 0.1%百里酚蓝； c. 0.1N氢氧化钠液、甲醛（试剂配制法同氨态氮的测定，见GB 5009.39-1996 氨基态氮测定法）。 2.3 操作 2.3.1 目测法 称取研细均匀的成曲样品10g，放入250mL锥形瓶中，加55℃温水30mL，充分摇匀，置于55℃水浴锅中保温3h，取出后加热煮沸以破坏酶活力，冷却后定容至100mL，充分摇匀后以脱脂棉过滤，吸取滤液10mL，移至150mL锥形瓶中，加水50mL，1%酚酞指示剂0.2mL，以0.1N氢氧化钠标准溶液滴定至刚显微红色（pH 8.2），记下滴定数作为总酸；继续加甲醛10mL，用0.1N氢氧化钠滴定至深红色（pH 8.5）为终点，若再加香草酚蓝1mL作指示剂，则滴至紫红色为终点。记下滴定数，减去空白数后计算成氨态氮。另称取1g曲做水分，再折算成干基数。 2.3.2 甲醛法 所用仪器、药品，操作方法等与氨态氮测定法同（见GB 5009.39-1996）。 2.4 计算 蛋白酶活力（克氨态氮/10g，干基） = [(V₁ - V₀) × N × 0.014 × 100] / [m × (100 - W)] 式中： V₁ - 加甲醛氧化钠标准液滴定数，mL； V₀ - 甲醛空白滴定数，mL； N - 氢氧化钠标准溶液的当量数； m - 称样量，g； W - 曲水分，%。 附加说明