本标准规定了乳酸菌饮料中乳酸菌检验的技术要求。本标准适用于以鲜乳、乳粉或辅以大豆等为原料，经乳酸菌发酵加工制成的具有相应风味的活性乳酸菌饮料。 GB/T 4789.35-2003 食品卫生微生物学检验乳酸菌饮料乳酸菌检验 GB/T4789.35-2003 标准下载解压密码：www.bzxz.net

1CS07.100.30
中华人民共和国国家标准
GB/T4789.35-2003
代替GB/T16347-1996
食品卫生微生物学检验
乳酸菌饮料中乳酸菌检验
Microbiological examination of food hygiene-Examination of Lactic acid bacteria in yoghurt beverage2003-08-11发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2004-01-01实施
GB/T4789.35-—2003
本标准对GB/T16347一1996《乳酸菌饮料中乳酸菌微生物学检验》进行修订。本标准与GB/T16347--1996相比主要修改如下：按照GB/T1.1-2000对标准文本的格式和文字进行修改。一修改和规范原标准方法中的“设备和材料”。本标准自实施之日起，GB/T16347--1996同时废止。本标准的附录A是规范性附录。
本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：南京市卫生防疫站、广东省食品卫生监督检验所、上海市食品卫生监督检验所、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人：陈晓蔚、刘敏、杨明、朱曼丹、翟明娟、周蓓君、杨宝兰、李志刚。原标准于1996年首次发布，GB/T4789.35—2003代替GB/T16347—1996。274
1范围
食品卫生微生物学检验
乳酸菌饮料中乳酸菌检验
本标准规定了乳酸菌饮料中乳酸菌检验的技术要求。GB/T4789.35—2003
本标准适用于以鲜乳、乳粉或辅以大豆等为原料，经乳酸菌发酵加工制成的具有相应风味的活性乳酸菌饮料。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T4789.1食品卫生微生物学检验方法总则GB/T4789.28食品卫生微生物学检验方法染色法、培养基和试剂3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
乳酸菌lacticacidbacteria
一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。
乳酸菌菌落总数lacticacidaerobicbacteria检样在一定条件下培养后，所得1mL(g)检样中所含乳酸菌菌落的总数。4设备和材料
4.1冰箱：0℃~4℃。
4.2恒温培养箱：36℃±1℃。
4.3恒温水浴锅：46℃士1℃。
4.4显微镜：10×~100×。
4.5均质器或灭菌乳钵。
4.6架盘药物天平：0g～500g，精确至0.5g。4.7锥形瓶：500mL。
4.8广口瓶：500mL。
4.9灭菌吸管：1mL（具0.01mL刻度），10mL（具0.1mL刻度）。4.10灭菌平血，直径90mm。
4.11灭菌刀、剪、镀子。
5培养基和试剂
5.1改良TJA培养基（改良番茄汁琼脂培养基）。275
GB/T4789.35-2003
5.2改良MC培养基（ModifiedChalmers培养基）。5.30.1%美蓝牛乳培养基。
5.46.5%氮化钠肉汤。
5.5pH9.6葡萄糖肉汤。
5.640%胆汁肉汤。
5.7淀粉水解培养基：见第A.7章。5.8精氨酸水解培养基：见第A.8章。5.9七叶苷培养基：见第A.10章。5.10
革兰氏染色液：按GB/T4789.28规定。13%过氧化氢溶液：按GB/T4789.28规定。5.11下载标准就来标准下载网
蛋白陈水、靛基质试剂：按GB/T4789.28规定。明胶培养基：按GB/T4789.28规定。硝酸盐培养基、硝酸盐试剂：按GB/T4789.28规定。0.85%灭菌生理盐水。
6乳酸菌菌落总数的测定
6.1检验程序
乳酸菌菌落总数检验程序见图1。检样
作成几个适当倍数的稀释液
选择2个～3个适当稀释度各以1mL加入灭菌培养皿内每皿内加入适负改良TJA或改良MC培养基36℃±172h±3h
菌落计数
6.2操作步骤
6.2.1以无菌操作将经过充分摇匀的检样25mL（g）放人含有225mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内作成1：10的均匀稀释液。
6.2.2用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液lmL，沿管壁徐徐注入含有灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均匀。6.2.3另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1mL灭菌吸管。
6.2.4选择2个～3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平血内，每个稀释度作两个平Ⅲ。276
GB/T4789.35—2003
6.2.5稀释液移入平Ⅲ后，应及时将冷至50℃的乳酸菌计数培养基（改良TJA或改良MC)注入平皿约15mL，并转动平Ⅲ使混合均匀。同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1mL稀释液检样用的灭菌生理盐水的灭菌平血内作空白对照，以上整个操作自培养物加入培养血开始至接种结果须在20min内完成。
6.2.6待琼脂凝固后，翻转平板，置36℃士1℃温箱内培养72h士3h，观察乳酸菌菌落特征（见表1)，选取菌落数在30～300之间的平板进行计数。计算后，随机挑取五个菌落数进行革兰氏染色，显微镜检查并做过氧化氢酶试验。革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌。根据证实为乳酸菌菌落计算出该血内的乳酸菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。例如，检样10的稀释液在改良TJA琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取五个鉴定，证实为乳酸菌的是四个，则1mL检样中乳酸菌数为：
35×4/5×10*=2.8×105
乳酸菌在改良TJA和改良MC培养基上菌落生长形态特征见表1。6.3
表1乳酸菌在不同培养基上菌落特征改良TJA
平皿底为黄色，菌落中等大小，微白色，湿润，改良MC
平皿底为粉红色，菌落较小，圆形，红色，边缘边缘不整齐，直径3mm士1mm，如棉絮团状菌落星状，直径2mm士1mm，可有淡淡的晕平皿底为黄色，菌落光滑，湿润微白色，边缘整齐
平Ⅲ底为粉红色，菌落较小，圆形，红色，边缘整齐，可有淡淡的晕
注，干酪乳杆菌在改良TJA培养基上为圆形光滑，边缘整齐，侧面呈菱形状。乳酸菌的鉴定
对上述分离到的乳酸菌需进行菌种鉴定时，作以下试验：7.1菌种制备：自平板上挑取菌落，接种于改良TJA或改良MC琼脂斜面，于36℃士1℃，24h～48h培养，刮取菌苔，分别进行下列试验。7.2乳酸杆菌鉴定试验极少见还原硝酸盐，不液化明胶，不产生靛基质和硫化氢。7.3常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应，见表2表2常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应七叶苔
干酪乳杆菌
干酪亚种
保加利亚乳杆菌
嗜酸乳杆菌
乳酸乳杆菌
纤维二糖
麦芽糖
注：d有些菌株阳性，有些菌株阴性；#弱、慢或阴性。7.4
产乳酸的链球菌的鉴别试验，见表3。甘露醇
表3产乳酸的链球菌的鉴别表
生长试验
嗜热链球菌
乳链球菌
乳脂链球菌
美蓝牛乳
注：d有些菌株阳性，有些菌株阴性。6.5%
氯化钠
水杨苷
山梁醇
精氨酸
GB/T4789.35—2003
附录A
（规范性附录）
专用培养基及试剂
A.1改良番茄汁琼脂培养基（改良TJA培养基）A.1.1成分
番茄汁
酵母抽提液
牛肉膏
葡萄糖
磷酸氢二钾（K,HPO.)
吐溢-80
乙酸钠
蒸馏水
pH6.8±0.2
A.1.2制法
加至1000mL
番茄汁的制作：将新鲜番茄洗净，切碎（切勿捣碎），放人锥形瓶，置4℃冰箱8h～12h，取出后用纱布过滤。如一次使用不完，可将其置人0℃冰箱，可保存四个月。使用时让其在常温下自然溶解。制法：将所有成分加入蒸馅水中，加热溶解，校正pH6.8士0.2。分装，高压灭菌121℃15min～20min。临用时加热熔化琼脂，冷至50℃时使用。A.2改良MC培养基
A.2.1成分
大豆蛋白陈
牛肉没膏
酵母浸膏
葡萄糖
碳酸钙
蒸馏水
1%中性红溶液
1000mL
硫酸多粘菌素B(酌情而加)10万IUA.2.2制法：将前面七种成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正pH6，加人中性红溶液。分装烧瓶，高压灭菌121℃15min～20min。临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，酌情加或不加硫酸多粘菌素B检样有胖听或开罐后有异味等有杂菌污染时，可加多粘菌素B，混匀后使用)。A.30.1%美蓝牛乳培养基
新鲜脱脂牛乳
1%美蓝水溶液
A.46.5%氯化钠肉汤
肉漫膏（pH7.6）
氯化钠
5pH9.6葡萄糖肉汤
普通肉汤校正pH9.6加人0.2%葡萄糖A.640%胆汁肉汤
pH7.6肉浸液
葡萄糖
牛胆汁
A.7淀粉水解培养基
pH7.6肉浸液琼脂
羊血清
GB/T4789.35—2003
3%淀粉溶液
将肉浸液琼脂溶化，待冷至50℃左右以无菌操作加人淀粉溶液及无菌羊血清混合后，倾注平板。A.8精氮酸水解培养基
蛋白陈
氯化钠
磷酸氢二钾
L-精氨酸
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液
蒸馏水
乳酸杆菌糖发酵管
A.9.1基础成分
牛肉膏
蛋白陈
酵母浸膏
吐温-80
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液
蒸馏水
1000mL
A.9.2按0.5%加入所需糖类，并分装小试管。A.10
七叶苷培养基
蛋白陈
GB/T4789.35—2003
磷酸氢二钾
七叶苷
构橼酸铁
1.6%溴甲酚紫酒精溶液
蒸馏水
1000mL
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