本标准规定了用微生物法测定食品中的维生素B6的含量。本标准适用于各类食品中的维生素B‘的测定。本标准也适用于饲料中的维生素B6的测定。本方法检出限为0.1ng,线性范围为0.1ng-6ng, GB/T 5009.154-2003 食品中维生素B6的测定 GB/T5009.154-2003 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS67.040
中华人民共和国国家标准
GB/T5009.154—2003
代替GB/T17407-1998
食品中维生素B6的测定
Determination of vitamin B in foods2003-08-11发布
中华人民共和国卫生部bzxZ.net
中国国家标准化管理委员会
2004-01-01实施
GB/T5009.154—2003
本标准对应于《AOAC.45维生素和营养素部分43.229食物中维生素B。的微生物测定法》（1995年版）。
本标准与AOAC43.229的一致性程度为非等效。本标准代替GB/T17407—1998《食品中维生素B。测定》。本标准按GB/T20001.4一2001《标准缩写规则第4部分：化学分析方法》对原标准的结构进行了修改。
本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所。本标推主要起草人：沈湘、周瑞华、杨晓莉、王光亚。原标准于1998年首次发布，本次为第一次修订。292
1范围
食品中维生素B。的测定
本标准规定了用微生物法测定食品中的维生素B。的含量。本标准适用于各类食品中的维生素B的测定。本标准也适用于饲料中的维生素B。的测定。本方法检出限为0.1ng，线性范围为0.1ng～6ng。2原理
GB/T5009.154—2003
食品中某一种细菌的生长必须要有某一种维生素的存在，卡尔斯伯（SaccharomycesCarlsbrgensis）醇母菌需在有维生素B，存在的条件下才能生长，在一定条件下维生素B。的量与其生长呈正比关系。用比浊法测定该菌在试样液中生长的浑浊度，与标准曲线相比较得出试样中维生索B。的含量。3试剂
3.1琼脂。
3.2吡哆醇Y培养基。
3.30.22mol/L硫酸溶液，于2000mL烧杯中加人700mL水，12.32mL硫酸（HzSO），用水稀释至1000mL。
3.40.5mol/L硫酸溶液，于2000mL烧杯中加人700mL水，28mL硫酸（H,SO）用水稀释至1000mL。
3.510mol/L氢氧化钠溶液，溶200g氢氧化钠于水中，稀释至500mL。3.60.1mol/L氢氧化钠溶液，取10mL10mol/L氢氧化钠，用水稀释至1000mL。3.7培养基：称取吡哆醇Y培养基5.3g，溶解于100mL蒸馏水中。替告：本标准所用吡哆醇Y培养基不得含维生素B。生长因子。3.8吡哆醇标准储备液（100μg/mL）：称取122mg盐酸吡哆醇标准溶于1L25%乙醇中，保于4℃冰箱中，稳定1个月。
3.9吡哆醇标准中间液（1μg/ml），取1mL吡哆醇标准储备液，稀释至100mL。3.10琼脂培养基：吡哆醇Y培养基5.3g，琼脂1.2g.稀释至100mL。3.11生理盐水：取9g氮化钠溶于1000mL水中。3.12溴甲酚绿(0.4g/L)：溶液，称取0.1g溴甲酚绿于研钵中，加1.4mL0.1mol/L氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释到250mL。4仪器和设备
4.1电热恒温培养箱。
4.2高压签。
4.3液体快速混合器。
4.4离心机。
4.5光栅分光光度计。
4.6硬质玻璃试管。
GB/T5009.154-2003
5分析步骤
5.1菌种的制备及保存（避光处理）5.1.1以卡尔斯伯酵母菌（SaccharomycesCarlsbergensisATCCNo,9080简称SC)纯菌种接人2个或多个琼脂培养基管中，在30℃士0.5℃恒温箱中保温18h～20h，取出于冰箱中保存，至多不超过两星期。保存数星期以上的菌种，不能立即用作制备接种液之用，一定要在使用前每天移种一次，连续2d～3d，方可使用，否则生长不好。5.1.2种子培养液的制备
加0.5mL50ng/mL的维生索B：标准应用液于尖头管中，加人5.0mL基本培养基，塞好棉塞，于高压锅121℃下消毒10min，取出，置于冰箱中，此管可保留数星期之久。每次可制备2管～4管。5.2试样处理（整个步骤需要避光）5.2.1称取试样0.5g~10.0g（维生素Bs含量不超过10ng）放入100mL三角瓶中，加72mL0.22mol/L硫酸。放人高压锅121℃下水解5h，取出冷却，用10.0mol/L氢氧化钠和0.5mol/L硫酸调pH值至4.5，用溴甲酚绿做指示剂。（指示剂由黄-黄绿色），将三角瓶内的溶液转移到100mL容量瓶中，用蒸馅水定容至100mL，滤纸过滤，保存滤液于冰箱内备用（保存期不超过36h）。5.2.2接种液的制备
使用前一天，将卡尔斯伯酵母菌菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中，可间时制备两根管，在30℃土0.5℃的恒温箱中培养18h~20h。取出离心10min（3000/min）倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗2次，再加10mL消毒过的生理盐水，将离心管置于液体快速混合器上混合，使菌种成为混悬体，将此液倒人已消毒的注射器内，立即使用。5.2.3标准曲线的制备
取标准储备液2.00mL稀释至200mL成为中间液，从中间液中取5.00mL稀释至100mL作为工作液，浓度为50ng/mL，3组试管各加0.00，0.02，0，04，0.08，0.12和0.16mL工作液，再加5.00mL吡哆醇Y培养基，混匀，加棉塞。5.2.4试样管的制备
在试管中分别加人0.05，0.10,0.20mL样液，再加人5.00mL吡哆醇Y培养基，用棉塞塞住试管，将制备好的标准曲线和试样测定管放人高压锅121℃下高压10min，冷至室温备用。5.2.5接种和培养
每管种一滴接种液，于30℃士0.5℃恒温箱中培养18h～22h。5.3测定
将培养后的标准管和试样管从恒温箱中取出后，用分光光度计于550nm波长下，以标准管的零管调零，测定各管的吸光度值。以标准管维生素B，所含的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制维生素B。标准工作曲线，用试样管得到的吸光度值，在标准曲线上查到试样管维生索B。的含量。6结果计算
试样中的维生系B含量按下式计算：X=cxVx100
m×100
式中：
X—试样中维生素B的含量，单位为旁克每百克(mg/100g)。C—试样提取液中维生素B的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)。294
各试样测定管中维生索B。的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)。一试样提取液的定容体积与稀释体积总和，单位为毫升（mL）。一试样质量，单位为克(g)。
100/10°——折算成每100g试样中维生素B：的毫克数。计算结果表示到小数点后两位。精密度
GB/T5009.154—2003
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。295
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