ICS11.220
DB37/T3821—2019 鸭新型呼肠孤病毒病诊断技术规范 Diagnostic techniques for novel duck reovirus disease (2019-12-24发布)
山东省市场监督管理局
2020-01-24实施

前言
本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施，本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院家禽研究所。
本标准主要起草人：于可响、宋敏训、李玉峰、马秀丽、刘存霞、姜亦飞、胡峰、元丽红、黄兵、郭效珍、刘玉山。

1 范围
本标准规定了鸭新型呼肠孤病毒病的临床诊断、实验室诊断和综合判定技术规范。本标准适用于鸭新型呼肠孤病毒病的诊断和流行病学调查。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室生物安全通用要求
兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
NY/T 541

3 术语和定义
3.1 鸭新型呼肠孤病毒病
又称“肉鸭脾坏死症”、“番鸭出血性坏死性肝炎”，是由鸭新型呼肠孤病毒引起的多品种雏鸭脾脏出血和坏死为主要特征的疾病。该病毒在血清学和基因序列上与原有的番鸭呼肠孤病毒有明显差异。

4 临床诊断
4.1 流行病学
该病一年四季均可发生，不同品种的鸭均可发病，如樱桃谷鸭、麻鸭、番鸭、半番鸭等；发病日龄一般为5～25日龄，其中以5～10日龄居多，病程5～7天。
4.2 临床症状
病鸭精神沉郁，发育不良，部分拉白色稀粪，一般不会出现神经症状，容易继发鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌等细菌感染。发病率5%～35%，死亡率20%以下。
4.3 病理变化
脾脏表面出血或坏死是其主要病变特征。
4.4 结果判定
符合4.1流行病学特征，病鸭出现4.2临床症状和4.3病理变化，可判为鸭新型呼肠孤病毒病疑似病例，应进行实验室确诊。

5 实验室诊断
除非另有规定，实验室诊断所用化学试剂均为分析纯；试验用水符合GB/T 6682二级水的规定；实验室生物安全要求按照GB 19489执行。
5.1 病原分离鉴定
5.1.1 仪器和设备
5.1.1.1 高速冷冻离心机。
5.1.1.2 恒温培养箱。
5.1.2 试剂或材料
5.1.2.1 青链霉素（青霉素10000IU/mL，链霉素10000μg/mL）。
5.1.2.2 0.22μm微孔滤器。
5.1.2.3 8日龄～9日龄鸭新型呼肠孤病毒抗体阴性鸭胚。
5.1.3 病料处理
按NY/T 541要求无菌采集发病鸭的脾脏1g～2g，加入10倍体积生理盐水和终浓度2000IU/mL的青链霉素，剪碎后充分研磨，反复冻融2次～3次，8000×g离心20min，取上清液用0.22μm微孔滤器过滤，经菌检无菌后用于病原分离。
5.1.4 操作步骤
5.1.4.1 取5.1.3中处理好的上清液经尿囊腔接种8日龄～9日龄鸭新型呼肠孤病毒抗体阴性鸭胚，0.1mL/枚，共5枚。封口后置于37℃恒温箱继续孵化，每日照胚两次，记录鸭胚死亡情况，观察到第6天。
若接种24h内死亡的鸭胚，应弃掉；若接种6天内鸭胚出现死亡，则收集死亡鸭胚的尿囊液，用5.2、5.3、5.4中的任意一种方法进行鉴定；若接种6天内鸭胚不出现死亡，则收集6天活胚的尿囊液，用5.2、5.3、5.4中的任意一种方法进行鉴定。
5.1.5 结果判定
5.1.5.1 阳性：接种后死亡鸭胚或接种后6天活胚的尿囊液用5.2、5.3、5.4中的任意一种方法检测为阳性。
5.1.5.2 阴性：接种后死亡鸭胚或接种后6天活胚的尿囊液用5.2、5.3、5.4中的任意一种方法检测为阴性。
5.2 RT-PCR方法
5.2.1 仪器和设备
5.2.1.1 高速冷冻离心机。
5.2.1.2 PCR扩增仪。
5.2.1.3 电泳仪。
5.2.1.4 紫外分析仪。
5.2.2 试剂或材料
5.2.2.1 TRIZol。
5.2.2.2 无RNA酶水。
5.2.2.3 反转录酶M-MLV。
5.2.2.4 RNA酶抑制剂。
5.2.2.5 Taq酶。
5.2.2.6 琼脂糖。
5.2.2.7 Goldview DNA染料。
5.2.2.8 阳性参照物（鸭新型呼肠孤病毒）。
5.2.2.9 阴性参照物（阴性尿囊液）。
5.2.3 操作步骤
5.2.3.1 样品处理
按NY/T 541要求无菌采集发病鸭的脾脏1g～2g，加入10倍体积生理盐水，用剪刀剪碎后，置于研磨器中充分研磨，反复冻融2次～3次，8000×g离心10min，取上清液100μL用于RNA提取。
5.2.3.2 RNA提取
5.2.3.2.1 在100μL病料上清液中加入1mL TRIZol，剧烈颠倒50次～100次，室温静置10min后，加入200μL氯仿，上下颠倒50次~100次，室温静置5min~10min，12000×g离心10min。
5.2.3.2.2 吸取上清加入等体积氯仿，上下颠倒50次~100次，12000×g离心10min。
5.2.3.2.3 吸取上清加入等体积的异丙醇，轻轻混匀后，-20℃静置至少30min，然后12000×g离心15min~20min。
5.2.3.2.4 弃上清液，加入1mL 75%酒精，12000×g离心5min~10min。
5.2.3.2.5 弃上清液，倒置自然晾干，或12000×g再离心5min，吸掉管底部的液体。
5.2.3.2.6 沉淀用20μL无RNA酶水溶解，备用。阳性和阴性参照物RNA的提取同上。样品RNA提取也可使用同等效果的商品化试剂盒。
5.2.3.3 引物
上游引物P1：5'-CATTCATTTGGGCAGCGG-3'
下游引物P2：5'-AGTAGTGTGTAAAGCATGGACT-3'
5.2.3.4 RT-PCR扩增
反转录（RT）反应
5.2.3.4.1 反应体系为10μL。在PCR管中加入dNTPs (10mM, 1μmol/L) 0.8μL，引物P1 (20μmol/L) 0.5μL，引物P2 (20μmol/L) 0.5μL，RNA 5.0μL，放PCR仪中70℃作用5min，然后取出冰浴1min～2min，再加入RNA酶抑制剂 (40U/L) 0.5μL，反转录酶M-MLV (200U/L) 0.7μL，5×M-MLV buffer 2μL，继续放PCR仪中42℃ 30min，95℃ 2min。
5.2.3.4.2 PCR扩增
5.2.3.4.2.1 反应体系