DB37/T3824.4—2019
青贮饲料质量检测与评价技术规范 第4部分：青贮饲料霉菌毒素检测技术规程

发布日期：2019-12-24
实施日期：2020-01-24
发布单位：山东省市场监督管理局

前言
DB37/T3824—2019《青贮饲料质量检测与评价技术规范》分为4个部分：一、第1部分：全株玉米制作青贮饲料机械揉搓质量评价技术规范；二、第2部分：青贮玉米中可吸收淀粉含量的测定；三、第3部分：多功能饲草粉碎机作业质量技术规范；四、第4部分：青贮饲料霉菌毒素检测技术规程。本部分为DB37/T3824—2019的第4部分。本部分按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本部分由山东省畜牧兽医局提出并组织实施，由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。
本部分起草单位：山东省畜牧总站、山东五征高北农牧机械有限公司、德州农慧农牧专业合作联合社、东营市畜牧兽医工作站、山东芳华农业机械有限公司。
本部分起草人：翟桂玉、刘栋、姜慧新、王兆凤、曹阳、刘刚、张文娟、仲崇岳、纪中良、王志坚、郭爱华、张磊、王玉霞。

1 范围
本标准规定了青贮饲料中霉菌毒素的酶联免疫吸附检测（ELISA）和高效液相色谱检测（HPLC）的方法、步骤和技术要求。本标准适用于青贮饲料中的霉菌毒素检测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 18980 乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法
GB/T 28716 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 免疫亲和柱净化-高压液相色谱法
GB/T 28718 饲料中T-2毒素的测定 免疫亲和柱净化-高压液相色谱法

3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 酶联免疫吸附法 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)：利用抗原抗体反应原理，将已知抗原吸附在酶标板上，加入酶标记抗体和样品提取液并混合均匀，充分反应后用去离子水洗去多余抗体，再加入酶的底物，产生有色物质，最后加入终止液使反应终止，用酶标仪测定酶底物的降解量，参照标准曲线计算试样中的抗原量。
3.2 高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)：试样中各组分在色谱柱的流动相和固定相间分配系数不同，在色谱柱中运行时，会反复多次吸附、脱附、释放，经过一定柱长后，彼此分离，顺序离开色谱柱进入检测器，产生的离子流信号经放大后，在记录器上描绘出各组分的色谱峰。高压液相色谱是把流动相改为高压输送，最高输送压力达 3.5×10 MPa，色谱柱用小粒径的填料填充的色谱分析方法。

4 酶联免疫吸附技术
4.1 试剂
本标准所用试剂，凡未指明规格者，均为分析纯，水为蒸馏水或同等纯度的水。
4.1.1 甲醇
4.1.2 石油醚
4.1.3 三氯甲烷
4.1.4 无水乙醇
4.1.5 乙酸乙酯
4.1.6 二甲基甲酰胺
4.1.7 四甲基联苯胺 (TMB)
4.1.8 吐温-20
4.1.9 30%过氧化氢 (30% H₂O₂)
4.1.10 抗T-2毒素单克隆抗体与辣根过氧化酶结合物
4.1.11 抗原：霉菌毒素与载体蛋白-牛血清白蛋白的结合物。

4.2 ELISA缓冲液系统
4.2.1 包被缓冲液为pH 9.6的碳酸盐缓冲液。配制方法：称取1.59g碳酸钠 (Na₂CO₃)，2.93g碳酸氢钠 (NaHCO₃)，加水稀释至1000mL。
4.2.2 洗液为含0.05%吐温-20的pH 7.4的磷酸盐缓冲液（简称为PBS-T）。配制方法：称取磷酸二氢钾 (KH₂PO₄) 0.2g，磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄·12H₂O) 2.9g，氯化钠 (NaCl) 8.0g，氯化钾 (KCl) 0.2g，吐温-20 0.5mL，加水至1000mL。
4.2.3 底物缓冲液为pH 5.0的磷酸一柠檬酸缓冲液。配制方法：
——甲液：0.1 mol/L柠檬酸 (C₆H₈O₇)，即称取柠檬酸19.2g，加水至1000mL；
——乙液：0.2 mol/L磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄)，即称取磷酸氢二钠71.7g，加水至1000mL；
——取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即可。
4.2.4 底物溶液：取50μL TMB（10mg TMB溶于1mL二甲基甲酰胺中）溶液 + 10mL底物缓冲液 + 10μL 30%过氧化氢，混匀。

4.3 霉菌毒素标准溶液
用甲醇配成1mg/mL霉菌毒素贮备液，-20℃冰箱贮存。于检测当天，精确吸取贮备液，用20%甲醇的PBS（配制方法：PBS-T，不加吐温-20即可）稀释成制备标准曲线的所需浓度。

5 仪器
所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡，用自来水、蒸馏水冲洗。
5.1 酶标检测仪。
5.2 酶标板（40孔或96孔）。
5.3 电动振荡器。
5.4 电热恒温水浴锅。
5.5 具0.2mL尾管的10mL小浓缩瓶。

6 测定步骤
6.1 提取
取样品通过20目筛粉碎的样品20g，置200mL具塞锥形烧瓶中，加8mL水和100mL三氯甲烷—无水乙醇（4：1），加塞密封，振荡1h，通过滤纸过滤，取25mL滤液于蒸发皿中，置90℃水浴上通风挥干。用50mL石油醚分次溶解蒸发皿中残渣，洗入250mL分液漏斗中，再用20mL甲醇—水（4：1）分次洗涤，转入同一分液漏斗中，振摇1.5min，静置约15min，收下层甲醇—水提取液。
6.2 层析净化
装备层析柱，在层析管中先装入0.5g中性氧化铝，敲平表面，再加入0.4g活性碳，敲紧，在层析柱下端与小管相连接处塞约0.1g脱纸棉，尽量塞紧，将6.1收集的提取液层析净化。
6.3 浓缩备用
将过柱后的洗脱液倒入蒸发皿中，并于水浴锅上浓缩至干，趁热加3mL乙酸乙酯，加热至沸，挥干后再重复一次，最后加3mL乙酸乙酯，冷至室温后转入浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯洗涤蒸发皿，并入浓缩瓶中。将浓缩瓶置95℃水浴锅上，挥干冷却后，用含20%甲醇的PBS定容，供ELISA检测之用。

7 ELISA检测
7.1 用霉菌毒素与载体蛋白结合物包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜。
7.2 酶标板用PBS-T洗3次，每次3min，后加入不同浓度的标准溶液（制作标准曲线）或样品提取液（检测样品毒素含量）与抗体—酶结合物溶液（1：100）的混合液（1：1，每孔100μL，该混合液应于使用的前一天配好，4℃过夜备用），置37℃孵育1.5h。
7.3 酶标板洗3次，每次3min，加入底物溶液。每孔100μL，37℃孵育30min。
7.4 用1mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50μL，于450nm处测定吸光度值。

8 计算
试样霉菌毒素浓度按式（1）计算：
霉菌毒素浓度 (ng/g) = (Cx × D × V2) / (V1 × m)
式中：
Cx —— 酶标板上所测得的霉菌毒素的量 (ng)，根据标准曲线求得；
V2 —— 样品提取液的体积 (mL)；
V1 —— 滴加样液的体积 (mL)；
D —— 样品总稀释倍数；
m —— 样品质量 (g)。

9 精密度
每个试样称取两份进行平行测定，以其算术平均值为分析结果，其分析结果的相对相差应不大于20%。

10 高效液相色谱测定技术 (HPLC)
10.1 试剂