DB21/T2875-2017 猪A群轮状病毒RT-PCR检测方法 前言 本标准按照GB/T1.1-2009规则起草，由辽宁省畜牧兽医局提出并归口，起草单位为辽宁省动物疫病预防控制中心和辽宁省动物医学研究院。主要起草人包括赵凤菊、顾贵波、关淼、陈瑞、杨本勇、门海滨、张雷、工冰、工海丰、周维及邓新。 1 范围 本标准规定了猪A群轮状病毒（PRV-A）RT-PCR检测方法的技术要求，适用于生物安全Ⅱ级（BSL-2）及以上实验室，对猪粪便、肠内容物及细胞培养物中的PRV-A核酸进行检测，用于病毒诊断、监测及流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本标准的应用是必不可少的，注日期的引用文件仅适用该日期版本，不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改）适用： - GB16548 病害动物和病害动物产品生物安全技术规范 - GB19489 动物实验室生物安全技术要求 - CB/T 19405.2 传染病动物检验实验室技术要求 3 缩略语 PRV-A：猪A群轮状病毒（Porcine A group rotavirus） RNA：核糖核酸（ribonucleic acid） RNase：核糖核酸酶（ribonuclease） DEPC：二乙基焦碳酸酯（diethyl pyrocarbonate） bp：碱基对（base pair） RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate） PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution） TAE：Tris-乙酸-EDTA电泳缓冲液（Tris-acetate-EDTA buffer） 4 原理 PRV-A为RVA病毒。其RNA经反转录生成cDNA作为PCR模板。根据PRV-A保守基因序列设计特异性引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，通过变性、退火和延伸反应体外扩增互补链DNA。 5 仪器和器材 5.1 高速台式冷冻离心机（0~20000 r/min） 5.2 冰箱：4℃、-20℃、-70℃各类型冰箱 5.3 PCR扩增仪 5.4 电泳仪 5.5 凝胶成像系统 5.6 微波炉 5.7 离心管：15 mL、1.5 mL、0.2 mL PCR专用管 5.8 微量可调移液器：1000 μL、200 μL、10 μL 6 试剂和引物 6.1 RNA抽提试剂：Trizol，淡粉色，4~8℃保存 6.2 氯仿：-20℃预冷 6.3 异丙醇：-20℃预冷 6.4 DEPC水：去离子水中加入0.1% DEPC 6.5 75%乙醇 6.6 阳性对照 6.7 阴性对照 6.8 PCR引物：用无水乙醇和DEPC水配制，-20℃预冷 6.9 PBS：磷酸盐缓冲液 6.10 TAE：Tris-乙酸-EDTA电泳缓冲液 6.11 溴化乙锭（EB） 6.12 DNA Marker DL2000 6.13 其他用于RT-PCR反应的分析纯或生化试剂