熊源性成分检测实时荧光PCR法技术规程DB15/T2834—2022 前言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草，由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。本文件由中华人民共和国二连海关起草，主要起草人包括陈少博、王伊琴、包勇敢、杨帆、荆文魁、张志峰、常鸿、赵治国。 1 范围 本文件规定了动物源性产品中熊源性成分实时荧光PCR检测方法。该方法适用于动物源性产品（如肉制品、皮毛制品、饲料等）中的熊源性成分的鉴定，灵敏度达到0.01ng/μL。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用构成本文件的必不可少的条款： - GB/T6682《分析实验室用水规格和试验方法》 - GB/T27403《食品分子生物学检测实验室质量控制规范》 3 术语和定义 3.1 PCR：实时荧光PCR，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。 3.2 Ct值（cycle threshold）：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 缩略语 本文件中的缩略语如下： - CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammonium bromide） - DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） - EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid） - FAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein） - PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） - TAMRA：羧基四甲基罗丹明（carboxy-tetramethyl-rhodamine） - Tris：三（羟甲基）氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane） 5 试剂与材料 5.1 水：符合GB/T6682的要求。 5.2 引物序列： - 上游引物：5'-CTCAGGAATAATTCTACTAACA-3' - 下游引物：5'-GAGCGATTGAAGAGTATG-3' - 探针序列：5'-(FAM)-TCGCACCTCTATCCGTCCTATATCA-(TAMRA)-3' 5.3 DNA提取试剂盒：用于从样品中提取DNA。 5.4 CTAB。 5.5 Tris-HCl（pH 8.0）。 5.6 NaCl。 5.7 EDTA。 5.8 蛋白酶K溶液（20mg/mL）。 5.9 三氯甲烷。 5.10 异丙醇。 5.11 75%乙醇。 5.12 实时荧光PCR预混液。 5.13 阳性对照样品：采用已知含有熊源性成分的DNA样品，或经测序确认的阳性质粒。 5.14 阴性对照样品：采用已知不含有熊源性成分的DNA样品。 5.15 空白对照：ddH2O。 6 仪器与设备 6.1 实时荧光PCR仪。 6.2 高速台式离心机（最高转速12000rpm）。 6.3 旋涡振荡器（最高转速3000rpm）。 6.4 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.5 恒温水浴锅。 6.6 天平（感量0.01g）。 6.7 单孔道微量移液器：0.5μL~10μL、10μL~100μL、20μL~200μL、100μL~1000μL。 7 实验方法 7.1 DNA提取：参照附录A中提取样品DNA的方法进行，也可使用等效商品化的组织基因组DNA提取试剂盒。当DNA浓度的吸光度值A260/A280在1.7～1.9之间时，适宜用于PCR扩增。设置至少两个平行样品，并设立阴性、阳性及空白提取对照。 7.2 实时荧光PCR检测 7.2.1 反应体系：反应体系体积为25.0μL，具体见表1。 7.2.2 反应条件：设置阴性对照、阳性对照和空白提取对照，进行实时荧光PCR检测。