ICS 65.120 B25 备案号：56303-2017 吉林省地方标准 DB22/T2688.3—2017 饲料中三种致病菌检测微滴数字PCR法 第3部分：产气荚膜梭菌 Determination of three pathogenic bacteria in feed by droplet digital PCR method Part 3: Clostridium perfringens 2017-09-30发布 2017-11-30实施 吉林省质量技术监督局 发布 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。DB22/T2688《饲料中三种致病菌检测微滴数字PCR法》分为三个部分： 第1部分：沙门氏菌； 第2部分：单核细胞增生李斯特氏菌； 第3部分：产气荚膜梭菌。 本部分为DB22/T2688的第3部分，由中华人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。 起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。 主要起草人：王准、曲辉、彭勃、罗雁非、王玮琳、李忠起、杨帆、刘金华、刘韬、李文君。 警示：使用本标准的人员应具备正规实验室工作经验。本标准未列出所有安全问题，使用者应采取适当安全与健康措施，并确保符合国家相关法规要求。 1 范围 本标准规定了饲料中产气荚膜梭菌检测微滴数字PCR法的试剂和材料、仪器设备、样品处理、试验步骤及试验数据处理。 本标准适用于饲料中产气荚膜梭菌的微滴数字PCR检测方法。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用必不可少。凡注日期的引用文件，仅所注日期版本适用；凡不注日期的引用文件，其最新版本（包括修改单）适用本文件。 GB 4789.1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则 GB 4789.13-2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料采样 GB 19489 实验室生物安全通用要求 WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用 3 原理 微滴数字PCR平台通过形成微小油包水体系实现反应体系分割，经PCR扩增后，根据泊松分布原理及阳性微滴数量与比例计算靶分子的起始拷贝数或浓度。本方法通过特异性引物和探针进行数字PCR扩增，实现饲料中产气荚膜梭菌的快速检测。 4 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T 6682中二级水要求。 4.1 菌株：产气荚膜梭菌相关标准菌株。 4.2 2× ddPCR预混液。 4.3 胰陈-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂，见GB 4789.13-2012中3.1。 4.4 缓冲蛋白胨水（BPW），见GB 4789.13-2012中3.6。 4.5 裂解液：2% CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），100 mmol/L Tris（三羟甲基氨基甲烷），1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸），用HCl调节pH至8.0。