ICS 65.120 B46 DB43 湖南省地方标准 DB43/T 889—2014 饲料中巴氯芬的测定 高效液相色谱法 Determination of Baclofen in feeds High performance liquid chromatographic method 2014-06-10发布 2014-08-10实施 湖南省质量技术监督局发布 前言 本标准按GB/T 1.1—2009的规则编制。本标准由湖南省畜牧水产局提出并归口。 本标准起草单位：湖南省兽药饲料监察所。 本标准主要起草人：易建希、武深树、陈福华、胡保国、肖安东、隆雪明、欧阳龙、魏群、何红艳、邓、周宇骏。 1 范围 本标准规定了饲料中巴氯芬高效液相色谱的测定方法。 本标准适用于本省配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料中巴氯芬的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料采样 GB/T 20195 动物饲料试样的制备 3 原理 采用稀酸溶液提取试样中含有的巴氯芬，经混合型阳离子固相萃取柱净化，氨化甲醇溶液洗脱，采用高效液相色谱法进行紫外检测，并以外标法定量。 4 试剂与材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T 6682规定的一级水。 4.1 甲醇（色谱纯） 4.2 乙腈（色谱纯） 4.3 磷酸（色谱纯） 4.4 偏磷酸 4.5 氨水 4.6 偏磷酸溶液：称取14.29 g偏磷酸，用水溶解并稀释至1 L。 4.7 流动相：取1 mL磷酸用水稀释至1 L，再按89:11的比例与乙腈混合，使用前超声脱气5 min。 4.8 氨水-甲醇溶液：将4 mL氨水与96 mL甲醇混合均匀。 4.9 标准品：巴氯芬，纯度≥98%。 4.10 标准储备液的配制：精确称取巴氯芬标准品10 mg（精确到0.00001 g），加适量甲醇超声溶解并用甲醇定容至50 mL容量瓶中，配制成浓度为0.2 mg/mL的标准储备液。4 ℃以下避光可保存3个月。 4.11 标准工作曲线的配制：准确移取适量巴氯芬标准储备液，用流动相配制成0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL、2.00 μg/mL、5.00 μg/mL的标准工作溶液，现配现用。 4.12 微孔滤膜：0.22 μm有机膜。 4.13 混合型阳离子固相萃取柱：MCX（60 mg/3 mL）或相当者。 5 仪器与设备 5.1 高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。 5.2 分析天平：感量0.00001 g和0.001 g。 5.3 固相萃取装置。 5.4 旋涡混匀器。 5.5 离心机：转速≥8000 r/min。 5.6 超声波清洗机。 5.7 恒温振荡器。 5.8 氮吹仪。 6 采样与试样的制备 6.1 采样按GB/T 14699.1的规定执行。 6.2 试样制备按GB/T 20195的规定执行。 7 分析步骤 7.1 提取 称取试样2 g（精确到0.001 g），置于100 mL具塞锥形瓶中，准确加入50.00 mL偏磷酸溶液，室温下超声提取10 min，振荡20 min（120 r/min）。静置分层，取上清液30 mL，于8000 r/min离心5 min，取上清液供固相萃取净化。 7.2 净化 将固相萃取柱依次用5 mL甲醇和5 mL水活化，准确移取5.00 mL上述提取液上柱，分别用5 mL水和5 mL甲醇淋洗，真空抽干。用5 mL氨水-甲醇溶液洗脱，收集全部洗脱液。固相萃取过程中流速控制在1 mL/min。洗脱液于50 ℃下氮气吹干，准确移取1.00 mL流动相溶解残留物，涡旋混合1 min，经微孔滤膜过滤后供高效液相色谱分析。 7.3 测定 7.3.1 高效液相色谱条件 色谱柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）或相当者；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；柱温：35 ℃；检测波长：220 nm。 7.3.2 高效液相色谱测定 取试样溶液和相应标准工作溶液进行测定，可采用单点或多点校准，以色谱图保留时间定性，峰面积积分值定量。标准工作液及试样溶液中巴氯芬的测定结果根据对应关系计算。