DB50/T953-2019 饲料中大肠杆菌O157的快速检测环介导等温扩增（LAMP）法 发布：2019-12-12 实施：2020-03-15 发布单位：重庆市市场监督管理局 起草单位：重庆市动物疫病预防控制中心、重庆市兽药饲料检测所 主要起草人员：胡健、周莉、侯亚莉、朱英才、盛欣、丁平、何义刚、张毅、王美珍、张军 前言 本标准按照GB/T1.1-2009规则起草，由重庆市农业农村委员会提出并归口实施，旨在规范饲料中大肠杆菌O157的快速检测方法。 1 范围 本标准规定了利用环介导等温扩增（LAMP）法检测饲料中大肠杆菌O157的原理、试剂、仪器设备、操作步骤、结果判定和表述方法，适用于饲料中大肠杆菌O157的筛选检测。 2 规范性引用文件 以下文件对于本标准的应用是必不可少的： - GB4789.36 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验 - GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 - GB19489 实验室生物安全通用要求 3 生物安全措施 培养物和废弃物处理应按照GB19489规定执行。 4 原理 通过热裂解法提取大肠杆菌O157的基因组DNA作为LAMP反应模板，根据O157的rfbE基因特异序列设计5条LAMP引物，建立LAMP反应体系，恒温反应结束后根据染料显色情况进行结果判断。 5 试剂 5.1 除另有规定外，试剂为分析纯，试验用水符合GB/T6682要求。 5.2 改良EC肉汤（mEC+n） 5.3 营养肉汤 5.4 生理盐水 5.5 双蒸水（ddH2O） 5.6 合成大肠杆菌O157检测用引物，包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP、环状下游引物LB，配置成100mmol/L储备浓度，用双蒸水稀释为10mmol/L工作浓度备用。 5.7 Bst DNA聚合酶 5.8 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs），包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP各10mmol/L 5.9 MgCl2溶液（50mmol/L） 5.10 10X Bst DNA聚合酶缓冲液（200mmol/L Tris-HCl pH8.8、100mmol/L KCl、100mmol/L (NH4)2SO4、20mmol/L MgSO4、1% Triton X-100） 5.11 甜菜碱，5mol/L溶液 5.12 钙黄绿素C，625μmol/L溶液 5.13 MnCl2，7.5mmol/L溶液 5.14 阳性对照：大肠杆菌O157标准菌株基因组DNA 6 仪器和设备 - 移液器：0.5μL~10μL，10μL~100μL，100μL~1000μL - 无菌均质袋，500mL - 锥形瓶，500mL - 水浴锅或恒温金属浴，精度±1℃ - 高速离心机，≥7000g - 恒温培养箱，精度±1℃ - 电子天平：感量0.01g或0.0001g 7 采样 7.1 采样原则 样品采集应遵循随机性和代表性原则，遵循无菌操作，防止外来污染。 7.2 采样方法 7.2.1 在同一批次产品中采集样品，每件样品量满足微生物检验要求，一般不少于500g（mL）。 7.2.2 独立包装不大于500g的固态产品或不大于500mL的液态产品，应取完整包装。 7.2.3 独立包装大于500mL液态产品，应采样前摇动或用无菌棒搅拌均匀，取样放入无菌采样容器，作为一个样品。