ICS 65.020.30
CCS B 42
DB37

山东省地方标准
DB37/T 4206—2020

渔用兽药 中草药中氯霉素的测定
液相色谱串联质谱法

Determination of chloramphenicol in fishery Chinese Traditional and Herbal Drugs by liquid chromatography tandem mass spectrometry

2020-11-10 发布
2020-12-10 实施

山东省市场监督管理局

前言

本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省农业农村厅提出并组织实施。本文件有山东省农业标准化委员会渔业标准化分技术委员会归口（鲁TC/SCO3）。
本文件起草单位：山东省淡水渔业研究院、青岛市华测检测技术有限公司。
本文件主要起草人：吴蒙蒙、姚建华、朱永安、武风娟、孙栋、赵华锋、张婵、郭芳芳、刘红彩。

渔用兽药 中草药中氯霉素的测定 液相色谱串联质谱法

1 范围
本文件规定了渔用兽药中草药中氯霉素测定的原理、试剂和耗材、仪器设备、样品、测定步骤、测量结果、检测方法灵敏度、回收率、精密度、线性范围。
本文件适用于渔用兽药中草药中氯霉素的测定方法。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中：注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。

4 原理
样品在碱性条件下经过乙酸乙酯振荡提取，提取液浓缩后乙腈复溶，经C18固相萃取小柱、液液分配净化后，液相色谱串联质谱仪测定，内标法定量。

5 试剂和耗材
5.1 水：GB/T 6682，一级。
5.2 乙酸乙酯：色谱纯。
5.3 乙腈：色谱纯。
5.4 甲醇：色谱纯。
5.5 氨水：分析纯。
5.6 50%乙腈水溶液：将50mL乙腈与50mL水混合均匀。
5.7 氯化钠：分析纯。
5.8 氯霉素标准品：氯霉素CAS 56-75-7，纯度不低于99.2%，于-18℃储存，有效期3年。标准溶液的配置如下：
a) 氯霉素标准储备液：称取氯霉素对照品10mg（精确至0.01mg）于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容，该溶液浓度为1mg/mL。-18℃避光保存，有效期为6个月。
b) 氯霉素标准工作液I：准确移取氯霉素标准储备液0.1mL于10mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容，该溶液浓度为10μg/mL。-18℃避光保存，有效期为3个月。
c) 氯霉素标准工作液II：准确移取氯霉素标准工作液I 0.1mL于10mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容。该溶液浓度为0.1μg/mL。-18℃避光保存，有效期为3个月。
5.9 氯霉素氘代内标：氯霉素-D5，纯度不低于99%，于-18℃储存，有效期3年。氘代氯霉素标准溶液的配置如下：
d) 氘代氯霉素储备液：称取氯霉素-D5 10mg（精确至0.01mg）于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容，该溶液浓度为1mg/mL。-18℃避光保存，有效期为6个月。
e) 氘代氯霉素标准工作液I：准确移取氘代氯霉素标准储备液0.1mL于10mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容，该溶液浓度为10μg/mL。-18℃避光保存，有效期为3个月。
f) 氘代氯霉素标准工作液II：准确移取氘代氯霉素标准工作液I 0.1mL于10mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容。该溶液浓度为0.1μg/mL。-18℃避光保存，有效期为3个月。
5.10 实验耗材
5.10.1 C18固相萃取柱：1000mg/6mL。
5.10.2 微孔滤膜：0.22μm，有机系。

6 仪器设备
6.1 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。
6.2 电子天平：感量0.0001g和0.01mg。
6.3 旋涡混合器。
6.4 离心机：转速不低于10000r/min。
6.5 固相萃取装置。
6.6 超声波震荡器。
6.7 旋转蒸发仪。

7 样品
从原始样品中取出部分有代表性样品，经高速组织捣碎机均匀捣碎或混匀，为保证样品均一性，全部过0.45mm筛，用四分法缩分出适量试样，均分成两份，装入清洁容器内，加封后作出标记，一份作为试样，一份作为留样。
液体样品混匀后取出部分作为试样，其余样品作为留样。

8 测定步骤
8.1 提取
称取2g（精确至0.001g）样品于50mL离心管，加入氘代氯霉素标准工作液II 40μL，加入8mL水，混匀后静置30min，加入0.5mL氨水，再加入30mL乙酸乙酯，振荡提取10min，10000r/min离心5min，取上层乙酸乙酯于鸡心瓶中，40℃旋转浓缩至近干，加入2mL乙腈涡旋混匀，取1mL加入4mL水混匀。
8.2 净化
依次用6mL乙腈和6mL水活化C18固相萃取柱，加载上样液并弃去，近自然滴干时，再加入15mL乙腈，收集洗脱液于50mL离心管中，加入约0.5g氯化钠使上述溶液饱和，振荡，4500r/min离心5min，取上层有机层于40℃氮吹浓缩至干。准确加入2mL乙腈溶液定容，过0.22μm滤膜。
8.3 标准工作曲线的制备
精确移取适量氯霉素标准工作液于10mL棕色容量瓶中，各加入氘代氯霉素标准工作液II 0.1mL，用乙腈水溶液稀释成浓度分别为0.2μg/L、0.5μg/L、0.8μg/L、1.0μg/L、5.0μg/L的标准溶液现用现配，供液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。
8.4 仪器测定
8.4.1 液相色谱条件
色谱柱：BEH C18柱，长50mm，内径2.1mm，粒径1.7μm，或性能相当者；
柱温：40℃；
流速：0.3mL/min；
进样量：3μL；
流动相：A：乙腈；B：水，梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱程序表
序号 | 时间/min | 流速/(mL/min) | A乙腈/% | B水/%
1 | 0.00 | 0.3 | 20 | 80
2 | 1.50 | 0.3 | 20 | 80
3 | 3.50 | 0.3 | 80 | 20
4 | 3.51 | 0.3 | 20 | 80
5 | 5.00 | 0.3 | 20 | 80

8.4.2 质谱条件
离子化模式及扫描方式：电喷雾负离子扫描（ESI）；
检测方式：多反应检测（MRM）；
毛细管电压（Capillary）：2.0kV；
脱溶剂温度（Desolvation Temperature）：400℃；
脱溶剂气流速（Desolvation）：1000L/Hr；
锥孔气流速（Cone）：150L/hr；
雾化气（Nebuliser）：7.0Bar；
定性离子对、定量离子对及电压、碰撞能量见表2。

表2 质谱参数
名称 | 氯霉素 | 氯霉素-D5
母离子 Parent m/z | 321.0 | 326.1
子离子 Daughter m/z (定量A) | 152.1 | 157.1
子离子 Daughter m/z (定性B) | 257.1 | 262.1
A的比例 % | 100 | 100
B的比例 % | 10 | 10
锥孔电压 Cone V | 25 | 25
碰撞能量 Collision Energy | 18 | 12

8.4.3 定性测定
在相同测定条件下，待测物在样品中的保留时间与标准工作液中的保留时间相对偏差在±2.5%之内，并且色谱图中定性离子对的相对丰度与浓度接近的标准工作液中相应定性离子对的相对丰度进行比较，若相对偏差不超过表3规定的范围，则可判断为样品中存在对应的待测物。

表3 相对丰度允许偏差范围
离子对类型 | 相对丰度允许偏差
定量离子对 | ±25%
定性离子对 | ±20%