DB32/T4964—2024
粳稻品种真实性和纯度SSR分子标记检测法
Variety genuineness and purity testing of japonica rice with SSR markers

发布日期：2024-12-27
实施日期：2025-01-27
发布机构：江苏省市场监督管理局
出版机构：中国标准出版社

前言
本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由江苏省农作物标准化技术委员会提出、归口并组织实施。
起草单位：扬州大学、江苏省种子管理站
主要起草人：冯志明、左示敏、陈宗祥、宋锦花、杨华、方明奎、沈雨晴、吕甜、高鹏、纪萌萌、杜海波。

1 范围
本文件给出了粳稻（Oryza sativa L. japonica）品种真实性，描述了检测方法和结果报告。本文件适用于江苏地区推广的粳稻品种的真实性验证和身份鉴定，也适用于粳稻常规种、杂交种及其亲本的纯度检测。江苏粳稻品种（包括常规种、杂交种及其亲本）的真实性和纯度测定可参照执行。
本文件不适用于粳稻实质性派生品种和转基因品种的鉴定。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，标注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不标注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 39917—2021 主要农作物品种真实性和纯度SSR分子标记检测法

3 术语和定义
GB/T 39917—2021 界定的术语和定义适用于本文件。

4 总则
简单序列重复（SSR）是一类由2个～6个碱基组成的串联重复DNA序列。水稻不同品种在SSR重复次数上会存在差异，这种变异可在世代间稳定遗传。筛选在品种间重复次数变异丰富的SSR位点是利用SSR分子标记鉴定品种真实性和纯度的关键。采用固定数量的SSR引物对待样品种的代表性样品DNA进行扩增和电泳检测，并通过与标准样品比较或与已知品种SSR指纹数据库比对，可对待样品种的真实性或身份进行鉴定。筛选能够鉴别品种群体中异常个体的SSR引物，进而利用其检测核种一定数量个体，根据检测到的异常个体数占比，可对该品种的整体一致性或纯度作出评价。
中国栽培稻分为粳稻和籼稻两个亚种，江苏水稻以粳稻为主，粳稻和籼稻在基因组组成和生态适应性上存在明显差异，造成一些SSR位点的重复次数差异在粳稻品种间存在，但却不存在于籼稻品种间。依据江苏粳稻品种间的序列变异特征，筛选在品种间变异丰富的SSR位点，结合GB/T 39917—2021中的SSR位点和检测流程，可提高SSR标记在江苏粳稻品种真实性和纯度检测中的鉴定效率。

5 检测方法
5.1 基本要求
检测平台、样品要求、仪器设备、试剂溶液配制、检测程序、DNA提取、PCR扩增、扩增产物分离和数据分析应符合GB/T 39917—2021的规定。
5.2 真实性检测
5.2.1 根据分辨率高、多态性信息含量值高、染色体分布均匀、与GB/T 39917—2021间的衔接等筛选原则，本文件确定76对SSR引物作为江苏粳稻品种真实性鉴定引物，其中48对为GB/T 39917—2021中的引物（编号为PR01~PR48），另外28对为新增引物（编号为R49~R76），见表1。
5.2.2 利用76对引物构建江苏已知粳稻品种及部分杂交粳稻品种的SSR指纹数据库。各对引物扩增的部分代表性带纹和品种见附录A。
5.2.3 进行品种真实性验证检测时，将76对SSR引物分为I组和Ⅱ组两组依次进行，其中I组为GB/T 39917—2021中的48对引物；Ⅱ组为新增的28对引物。在I组引物检测中，若检测到可以判定“否定”结果的差异位点数，应终止检测；未检测到或检测到但未达到可以判定“否定”结果的差异位点数的，应继续完成Ⅱ组引物的检测。
5.2.4 进行品种真实性身份鉴定检测时，应完成全部76对引物检测，可采用I组和Ⅱ组序贯方式进行，也可采用其他次序进行。利用江苏已推广品种的SSR指纹数据库，通过指纹数据比对筛查确定具体品种。经比较后与已知品种存在没有位点差异或差异位点数不足而无法得出结论或有争议的，允许采用田间种植鉴定方法等其他方法进行进一步检测鉴定。
5.3 纯度检测
5.3.1 品种纯度检测所选的引物，应通过检测样品预试验，从76对SSR引物中筛选出能够准确识别该样品品种中异常个体的引物。
5.3.2 异常个体的类型不同，所选引物和数目也应不同。筛选时应结合引物的杂合度、DNA快速提取和多重引物组合电泳的潜力，选择合适引物。注：杂交种异常个体主要类型为与杂、异交、混杂；常规种和杂交亲本种子异常个体为异交、混杂。
5.3.3 筛选结果表明样品在个别位点存在遗传不稳定状况的可将其剔除；检测样品存在严重遗传不稳定状况的可终止纯度测定。
5.4 引物合成
5.4.1 真实性检测或身份鉴定引物表1给出了28对新增的真实性验证或身份鉴定引物，其中各引物染色位置参考的基因组版本号为Os-Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0。选用PAGE电泳，只需合成普通引物；选用荧光毛细管电泳，应在正向引物的5'端标记荧光染料合成引物，采用单引物或组合引物电泳。