ICS 65.020.30 B41 江苏省地方标准 DB32/T1774-2011 鸭H9亚型禽流感病毒与副粘病毒的检测 双重RT-PCR方法 Method of Multiplex RT-PCR Detecting H9 Subtype Avian Influenza Virus (AIV) and Duck Paramyxovirus (DPV) 发布日期：2011-05-06 实施日期：2011-07-06 发布单位：江苏省质量技术监督局 前言 为规范鸭H9亚型禽流感病毒与鸭副粘病毒双重RT-PCR分子生物学检测技术，提高两种病毒混合感染检测的灵敏度、稳定性和特异性，制定本标准。本标准按GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准结构和编写规则》编制。 本标准由江苏省农业科学院提出并起草。 主要起草人：魏雪涛、李银、刘宇卓、张敬峰。 1 范围 本标准规定了鸭H9亚型禽流感病毒与副粘病毒双重RT-PCR检测方法的引物设计、样品范围、操作流程及反应条件等技术要求。本标准适用于鸭H9亚型禽流感病毒与副粘病毒单一感染或混合感染的实验室诊断、临床诊断、流行病学调查及分离毒株的鉴定。 适用样品包括鸭组织、分泌物、排泄物及鸭胚尿囊液中的病毒核酸检测。 2 规范性引用文件 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541-2002 动物疫病实验室检验采样方法 NY/T 772-2004 禽流感病毒RT-PCR试验方法 3 原理 聚合酶链式反应（PCR）是一种体外扩增特定DNA片段的分子生物学技术，具有快速、灵敏和特异性强的特点。双重RT-PCR技术可在一次反应中同时检测两种病原体，适用于混合感染的鉴别诊断。 本方法参考NY/T 772-2004中H9亚型禽流感病毒检测方法，并根据GenBank公布的鸭副粘病毒血凝素（HA）基因保守序列设计特异性引物，从而实现对两种病毒单独感染或混合感染的准确检测。 4 仪器设备与主要试剂 4.1 仪器设备 包括PCR仪、离心机、电泳槽、微量移液器和凝胶成像系统。 4.2 主要试剂 包括TRIzol、氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC处理的灭菌双蒸水、AMV反转录酶、5×AMV Buffer、dNTP、RNA酶抑制剂、MgCl2、Ex Taq DNA聚合酶及其缓冲液、DNA Marker DL-2000和琼脂糖等。 5 引物 5.1 反转录引物 H9AIV：5′-AGCAAAAGCAGG-3′； DPV：5′-GGAGGATGTTGGCAGCATT-3′。 5.2 PCR扩增引物 H9AIV： 上游引物：5′-TCAACAAACTCCACCGAAACTGT-3′； 下游引物：5′-TCCCGTAAGAACATGTCCATACCA-3′。 DPV： 上游引物：5′-TTGATGGCAGGCCTCTTGC-3′； 下游引物：5′-GGAGGATGTTGGCAGCATT-3′。 6 样品采集 按照NY/T 541-2002执行。对病死或扑杀鸭，采集肺脏、脾脏等组织；对活体鸭，用棉拭子采集气管分泌物或泄殖腔排泄物，置于50%甘油生理盐水中保存。 阴性对照为健康鸭组织样品，阳性对照为经血凝抑制试验确认的阳性尿囊液。 7 方法步骤 试验用水应符合GB/T 6682-2008三级水标准。 7.1 样品处理 取0.5 g～1 g待检组织剪碎研磨，反复冻融后用生理盐水按1:5稀释，12000 r/min离心10 min，取上清200 μL备用。 分泌物和排泄物样品处理：将拭子在50%甘油生理盐水中充分振荡并挤干后弃去拭子，在4℃下12000 r/min离心10 min，取上清200 μL备用。 7.2 病毒RNA提取 以处理后的样品为检测对象，同时设置阳性对照（含H9亚型禽流感病毒、鸭副粘病毒及混合样品）、阴性对照（SPF鸡胚尿囊液）及空白对照（无菌水）。采用TRIzol法提取病毒RNA。