中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4073—2014 芒果细菌性黑斑病菌快速检测方法 Detection and identification of Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae 2014-11-19 发布 国家质量监督检验检疫总局 2015-05-01 实施 前言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、福建农林大学。 本标准主要起草人：王念武、黄伙水、陈劲松、沈建国、王宏毅、翁瑞泉、黄振、胡方平。 1 范围 本标准规定了芒果细菌性黑斑病菌 Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae 的检疫鉴定方法。 本标准适用于进出境芒果的果实、叶片、枝条，组织繁殖材料中可能携带芒果细菌性黑斑病菌的检疫鉴定。 芒果细菌性黑斑病菌基本信息 学名：Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae 分类地位：变形细菌门（Proteobacteria），$gamma$-变形细菌纲（Gammaproteobacteria），黄单胞菌目（Xanthomonodales），黄单胞菌科（Xanthomonodaceae），黄单胞菌属（Xanthomonas）、黑腐黄单胞菌（Xanthomonas campestris）、黑腐黄单胞菌芒果致病变种（Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae） 传播途径：远距离传播主要靠带菌苗木、接穗和果实的调运。其他信息参见附录 A。 3 方法原理 根据芒果细菌性黑斑病菌的致病基因 hrpB 特有碱基序列设计引物进行 PCR 扩增，并结合半选择性培养基上的培养性状，对该菌进行检疫鉴定。 4 仪器设备和主要试剂 4.1 仪器设备 PCR 仪、高压灭菌锅、制冰机、高速冷冻离心机、离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器、电泳仪、凝胶成像系统、天平（感量：0.001g）、高温干燥箱、震荡培养箱、生物安全柜、可调移液枪。 4.2 主要试剂 半选择性培养基 NCTM3 和 NA 培养基试剂见附录 B，PCR 检测试剂见附录 C。 5 检测鉴定方法 5.1 症状检查 仔细观察芒果的果实，叶片和枝条，症状描述参见附录 A。 5.2 检疫样品的采集及制备 取有疑似症状的芒果果实、叶片、枝条等进行实验室检测鉴定。 5.3 特异性引物的 PCR 初筛 提取可疑样品 DNA，采用特异性引物 Xcm1/Xcm2 进行 PCR 检测。设阳性对照、阴性对照和空白对照，进行 PCR 扩增，扩增产物进行电泳分析。具体操作和判定见附录 C。 5.4 细菌分离培养 使用半选择性培养基 NCTM3 分离。取疑似症状的样品（参见附录 A），用清水冲洗干净，晾干后用灭菌的解剖刀在病健交界处取一小块病变组织，悬浮于少量无菌水中，用无菌玻棒挤压，然后用接菌环蘸取菌悬液，在 NCTM3 培养基（配制方法见附录 B）平皿上划线分离，28 ℃ 下恒温培养 5 d。挑取疑似单菌落（圆形，乳白色，黏液状，中央隆起，边缘清晰，大小 3.0mm～4mm），划线纯化四次后备用。 5.5 分离菌株特异性引物 PCR 扩增确认 采用特异性引物 Xcm1/Xcm2 对分离疑似菌株进行 PCR 检测。设阳性对照、阴性对照和空白对照，进行 PCR 扩增，扩增产物进行电泳分析。具体操作和判定见附录 C。 6 结果判定 6.1 在 5.3 特异性引物的 PCR 初筛中，若出现阴性结果，则判定为样品未携带芒果细菌性黑斑病菌；若出现阳性结果，继续进行 5.4 细菌分离试验。阳性、阴性结果的判定见附录 C。 6.2 在 5.4 细菌分离的基础上，若未出现疑似菌落，则判定样品未携带芒果细菌性黑斑病菌；若出现疑似菌落，则需进行 5.5 特异性引物 PCR 扩增继续判定。 6.3 在 5.5 分离菌株特异性引物 PCR 扩增确认中，若出现阳性结果，则判定为样品带有芒果细菌性黑斑病菌；若出现阴性结果，判定为样品未携带芒果细菌性黑斑病菌。阳性、阴性结果的判定见附录 C。 7 样品保存 7.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出的芒果细菌性黑斑病菌的样品应保存于 -20 ℃ 冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌杀死病菌后方可做丢弃处理。 7.2 菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为芒果细菌性黑斑病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于 NA 培养基斜面上，28 ℃ 培养 48 h，然后 4 ℃ 冰箱保存，或液体培养至对数生长期，加入 20% 灭菌甘油并混匀，-80 ℃ 长期保存，或用安管冷冻干燥长期保存。