YY/T 1695-2020
基本信息
标准号： YY/T 1695-2020
中文名称：人类辅助生殖技术用医疗器械培养用液中氨基酸检测方法
标准类别：医药行业标准(YY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 人类 辅助 生殖 技术 医疗器械 培养 氨基酸 检测 方法
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
YY/T 1695-2020.Medical devices for human assisted reproductive technology-Determination of amino acids in human assisted reproductive media.
1范围
YY/T 1695规定了用氨基酸分析仪法.高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪法.高效液相色谱柱前街生法检测人类辅助生殖技术用培养用液中氨基酸成分。
YY/T 1695适用于，人类辅助生殖技术用培养用液中所含甘氨酸(GLY)、亮氨酸(LEU).蛋氨酸(MET) .酪氨酸(TYR).组氨酸(HIS).苏氨酸(THR).丙氨酸(ALA).异亮氨酸(ILE).色氨酸(TRY) .胱氨酸(CYS) .赖氨酸(LYS) .天门冬氨酸(ASP)、缬氨酸(VAL)、苯丙氨酸(PHE)、脯氨酸(PRO)、丝氨酸(SER) .谷氨酸(GLU) .精氨酸(ARG) .牛磺酸(TAU)19种氨基酸的定量分析。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注8期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实 验室用水规格和试验方法
JJG 1064- -2011氨基酸分 析仪检定规程
YY/T 0995人类辅助生殖技术用医疗器械 术语和定 义
3术语和定义.
YY/T 0995界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1
氨基酸分析仪法amino acid analyzer氨基酸分析仪中离子交换色谱柱将样晶中不同的氨基酸分离，并以茚三酮做柱后行生后,在570 nm和140 n波长下测定,以外标法进行定量。
3.2
高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪法hig-performance liquid chromatogrnaphy coupled to tan-dem mass spectrometry高效液相色谱将样品中的待测成分初步分离开,三重四级杆质谱仪对分开的待测成分通过筛选母离子质核比得到待测离子,待测离子经碰撞后碎裂成子离子,最后通过子离子的碎片强度定量待酬成分。
3.3
高效液相色谱柱前衍生法high-performance liquid chromatography pre-column derivatization andanalysis method待测组分先通过術生化反应,转化为街生化产物,然后经过色谱柱与样品中的其他组分分离,再通过外标法进行定量。
1范围
YY/T 1695规定了用氨基酸分析仪法.高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪法.高效液相色谱柱前街生法检测人类辅助生殖技术用培养用液中氨基酸成分。
YY/T 1695适用于，人类辅助生殖技术用培养用液中所含甘氨酸(GLY)、亮氨酸(LEU).蛋氨酸(MET) .酪氨酸(TYR).组氨酸(HIS).苏氨酸(THR).丙氨酸(ALA).异亮氨酸(ILE).色氨酸(TRY) .胱氨酸(CYS) .赖氨酸(LYS) .天门冬氨酸(ASP)、缬氨酸(VAL)、苯丙氨酸(PHE)、脯氨酸(PRO)、丝氨酸(SER) .谷氨酸(GLU) .精氨酸(ARG) .牛磺酸(TAU)19种氨基酸的定量分析。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注8期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实 验室用水规格和试验方法
JJG 1064- -2011氨基酸分 析仪检定规程
YY/T 0995人类辅助生殖技术用医疗器械 术语和定 义
3术语和定义.
YY/T 0995界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1
氨基酸分析仪法amino acid analyzer氨基酸分析仪中离子交换色谱柱将样晶中不同的氨基酸分离，并以茚三酮做柱后行生后,在570 nm和140 n波长下测定,以外标法进行定量。
3.2
高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪法hig-performance liquid chromatogrnaphy coupled to tan-dem mass spectrometry高效液相色谱将样品中的待测成分初步分离开,三重四级杆质谱仪对分开的待测成分通过筛选母离子质核比得到待测离子,待测离子经碰撞后碎裂成子离子,最后通过子离子的碎片强度定量待酬成分。
3.3
高效液相色谱柱前衍生法high-performance liquid chromatography pre-column derivatization andanalysis method待测组分先通过術生化反应,转化为街生化产物,然后经过色谱柱与样品中的其他组分分离,再通过外标法进行定量。
标准图片预览
标准内容
ICS_11.040.30
中华人民共和国医药行业标准
YY/T1695—2020
人类辅助生殖技术用医疗器械
培养用液中氨基酸检测方法
Medical devices for human assisted reproductive technology-Determination of amino acids in human assisted reproductive media2020-03-31发布
国家药品监督管理局
2021-04-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。YY/T1695—2020
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家药品监督管理局提出。本标准由中国食品药品检定研究院归口。本标准起草单位：中国食品药品检定研究院。本标准主要起草人：柯林楠、黄元礼、赵丹妹、方玉、韩倩倩、王春仁、段晓杰。I
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1范围
人类辅助生殖技术用医疗器械
培养用液中氨基酸检测方法
YY/T1695—2020
本标准规定了用氨基酸分析仪法、高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪法、高效液相色谱柱前衍生法检测人类辅助生殖技术用培养用液中氨基酸成分。本标准适用于人类辅助生殖技术用培养用液中所含甘氨酸（GLY)、亮氨酸（LEU)、蛋氨酸（MET)、酪氨酸（TYR）、组氨酸（HIS）、苏氨酸（THR）、丙氨酸（ALA）、异亮氨酸（ILE）、色氨酸（TRY）、胱氨酸（CYS)、赖氨酸（LYS）、天门冬氨酸（ASP）、缬氨酸（VAL）、苯丙氨酸（PHE）、脯氨酸(PRO)、丝氨酸（SER）、谷氨酸（GLU)、精氨酸（ARG)、牛磺酸（TAU)19种氨基酸的定量分析。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法JJG1064—2011氨基酸分析仪检定规程YY/T0995人类辅助生殖技术用医疗器械术语和定义3术语和定义
YY/T0995界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1
氨基酸分析仪法amino acidanalyzer氨基酸分析仪中离子交换色谱柱将样品中不同的氨基酸分离，并以节三酮做柱后衍生后，在570nm和440nm波长下测定，以外标法进行定量。3.2
高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪法high-performanceliquidchromatographycoupledtotandemmassspectrometry
高效液相色谱将样品中的待测成分初步分离开，三重四级杆质谱仪对分开的待测成分通过筛选母离子质核比得到待测离子，待测离子经碰撞后碎裂成子离子，最后通过子离子的碎片强度定量待测成分。
高效液相色谱柱前衍生法high-performanceliquidchromatographypre-columnderivatizationandanalysismethod
待测组分先通过衍生化反应，转化为衍生化产物，然后经过色谱柱与样品中的其他组分分离，再通过外标法进行定量。
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4方法一：氨基酸分析仪法（仲裁法）4.1原理
不同氨基酸有不同的色谱表现，通过氨基酸分析仪的离子交换色谱柱分离后，以节三酮做柱后衍生后进行测定，以外标法定量。
注：氨基酸分析仪法测定含有二肽，如丙氨酰-谷氨酰胺等培养用液时，胱氨酸(CYS)定量会受到培养用液中二肽的干扰，不适宜采用该法。bZxz.net
4.2试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。4.2.1不同pH和离子强度的洗脱用柠檬酸锂缓冲液：按仪器使用说明书配制或购买。4.2.2节三酮溶液：按仪器使用说明书配制或购买4.2.34%磺基水杨酸溶液：称取磺基水杨酸4g，加水稀释至100mL。4.2.4
0.1mol/L盐酸溶液：取盐酸9mL，加水适量使成1000mL，摇匀。4.2.50.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，加新沸过的冷水使成1000mL，摇匀。4.2.619种氨基酸对照品：国家（或国际）标准品或可量值溯源的对照品。4.3对照品溶液配制
氨基酸对照品储备液
分别取氨基酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液溶解并定容至刻度，制成氨基酸对照品储备液。称取L-色氨酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加少许水和数滴0.1mol/L氢氧化钠，使之溶解，加水定容至刻度。4.3.2混合氨基酸对照品系列溶液吸取单个氨基酸对照品储备液适量，置于同一容量瓶中，加水稀释配制成混合氨基酸对照品储备液。将混合氨基酸对照品储备液稀释，配制成混合氨基酸对照品系列溶液，使各氨基酸浓度在1μg/mL～100μg/mL范围。4℃冰箱保存一周。4.4仪器
4.4.1电子天平，精度为0.0001g。4.4.2氨基酸分析仪。
4.4.3高速离心机。
4.4.4涡旋振荡器。
试样制备
精密移取一定量样品，加水稀释至各氨基酸浓度在1μg/mL～100μg/mL范围。样品中如含有蛋白质，取样品0.5mL，加0.5mL4%磺基水杨酸，混匀后，9500g离心10min，取上清液备用。若上清液中各氨基酸浓度不在1μg/mL～100μg/mL范围，应用水将浓度稀释至该范围。
4.6分析步骤
4.6.1仪器调试
使用混合氨基酸对照品系列溶液注氨基酸分析仪，参照JJG1064一2011《氨基酸分析仪检定规2
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程》及仪器说明书，适当调整仪器操作程序及参数和洗脱用缓冲溶液试剂配比，确认仪器操作条件。4.6.2测试
在上述测试条件下，取混合氨基酸对照品系列溶液和样品溶液（或供试液）20μL，分别注入氨基酸分析仪，以各氨基酸对照品峰面积为纵坐标，氨基酸对照品浓度为横坐标，绘制各氨基酸标准曲线，计算回归方程。
4.7结果计算与表示
4.7.1样品中各氨基酸含量
样品中各氨基酸含量按式(1)计算：X,=C, XK
式中：
X，—样品中氨基酸i含量，单位为微克每毫升（μg/mL)；C，一—根据回归方程计算样品测定液中氨基酸i含量，单位为微克每毫升（μg/mL)；K试样稀释倍数。
4.7.2结果表示
以两个平行试样测定结果的算术平均值报告结果。4.8质量控制
4.8.1分离度
各氨氮基酸分离度≥85%。
4.8.2空白分析
每次分析至少做一个实验室空白，实验室空白中检出每个目标化合物的浓度不得超过方法的检出限。
4.8.3校准
每批样品应绘制标准曲线，相关系数应≥0.995，否则应重新绘制标准曲线。每20个样品或每批次样品（少于20个样品）应测定一个标准曲线中间浓度点标准溶液，其测定结果与该点浓度的相对偏差应≤15%，否则应重新绘制标准曲线，4.8.4平行样测试
每个样品需做平行双样，平行双样测定结果的相对偏差应15%。5方法二：高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪法5.1原理
通过乙睛沉淀人类辅助生殖技术用培养用液中的蛋白质，离心取得上清液后，通过高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪分离检测，根据保留时间及特征离子质核比定性，外标法定量。3
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5.2试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。5.2.1乙腈，色谱纯。
5.2.2甲酸，色谱纯。
5.2.30.1mol/L盐酸溶液取盐酸9mL，加水适量使成1000mL，摇匀。5.2.40.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，加新沸过的冷水使成1000mL，摇勾。5.2.519种氨基酸对照品：国家（或国际）标准品或可量值溯源的对照品。氨基酸对照品溶液配制
5.3.1氨基酸对照品储备液
分别取氨基酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液溶解并定容至刻度，制成氨基酸对照品储备液。称取L-色氨酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加少许水和数滴0.1mol/L氢氧化钠，使之溶解，加水定容至刻度。5.3.2混合氨基酸对照品系列溶液移取单个氨基酸对照品储备液适量，置于同一容量瓶中，加空白溶液（与待测样品基质相同，但不含氨基酸及蛋白）稀释配制成混合氨基酸对照品储备液。将混合氨基酸对照品储备液空白溶液稀释，配制成混合氨基酸对照品系列溶液，使各氨基酸浓度在0.05μg/mL～1μg/mL范围。5.4仪器
5.4.1高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪，配电喷雾离子化源（ESI)。5.4.2电子天平，精度为0.0001g。5.4.3高速离心机。
5.4.4涡旋振荡器。
5.5试样制备
精密移取一定量样品，加水稀释至各氨基酸浓度在0.05μg/mL～1μg/mL范围。样品中如含有蛋白质，取样品100μL，加200μL乙，涡旋混匀后，9500g离心10min，取上清液备用。若上清液中各氨基酸浓度不在0.05μg/mL~1μg/mL范围，应用水将浓度稀释至该范围。5.6分析步骤
5.6.1仪器参考条件
5.6.1.1高效液相色谱仪参考条件高效液相色谱仪参考条件如下：色谱柱：填料为3μm五氟苯基柱，柱长150mm、内径2.1mm的色谱柱或其他性能相似的色a)
谱柱。
流动相：A为100%水（含0.1%甲酸溶液）；B为100%乙腈（含0.1%甲酸溶液）。b）
流速：0.35mL/min。
柱温：40℃。
进样量：1.0μL。
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梯度洗脱程序见表1。
时间/min
流动相梯度洗脱程序
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流动相B比例/%
对不同色谱柱及液相，洗脱程序可能存在差异，测定前宜将程序优化到最佳5.6.1.2
质谱仪参考条件
质谱仪参考条件如下：
离子源：电喷雾离子源；
离子检测方式：多反应监测；
离子源接口电压：-3.0kV；
雾化气：氮气，3.0L/min；
干燥气：氮气，10L/min；
加热气：空气，10L/min；
碰撞气：氩气；
脱溶剂管温度：250℃；
加热模块温度：400℃；
接口温度：300℃。
19种氨基酸的质谱分析条件参数见表2。19种氨基酸的质谱分析参数”
氨基酸名称
甘氨酸
丙氨酸
脯氨酸
丝氨酸
缬氨酸
定量离子/（m/z）
75.90>30.15
89.90>44.10
116.0>70.15
105.90>60.10
118.00>57.10
离子极性
正离子
正离子
正离子
正离子
正离子
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Q1Prerod
bias/V
Q3Prerod
bias/v
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氨基酸名称
苏氨酸
亮氨酸
异亮氨酸
天冬氨酸
赖氨酸
谷氨酸
甲硫氨酸
组氨酸
苯丙氨酸
精氨酸
酪氨酸
胱氨酸
色氨酸
牛磺酸
定量离子/(m/z）
120.10>74.15
132.10>30.05
132.10>69.15
134.00>74.05
147.20>130.10
147.90>84.10
149.90>56.10
155.90>110.10
166.10>103.10
175.20>60.10
182.10>136.10
241.00>73.90
205.10>188.15
124.15>79.90
表2(续）
离子极性
正离子
正离子
正离子
正离子
正离子
正离子
正离子
正离子
正离子
正离子
正离子
正离子
正离子
负离子
Q1Prerod
bias/v
对不同质谱仪，参数可能存在差异，测定前宜将质谱参数优化到最佳。5.6.1.3
仪器调谐
Q3Prerod
bias/v
按照仪器使用说明书在规定时间和频次内对高效液相色谱串联质谱仪进行仪器质量数和分辨率校正，其中仪器质量数偏移在士0.5Da之内，质谱峰半峰宽在0.6Da～0.9Da，以确保仪器处于最佳测试状态。
注：Da，道尔顿(Dalton)的缩写，指以人名命名的原子质量单位。5.6.2测试
在上述测试条件下，取混合氨基酸对照品系列溶液和样品溶液（或供试液）1μL，分别注人仪器，以6
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各氨基酸对照品峰面积为纵坐标，氨基酸对照品浓度为横坐标，绘制各氨基酸标准曲线，计算回归方程。5.7结果计算与表示
5.7.1样品中各氨基酸含量
样品中各氨基酸含量按式（2)计算：X,=C,XK
式中：
X：—样品中各氨基酸i含量，单位为微克每毫升（μg/mL)；C，一根据回归方程计算样品测定液中氨基酸i含量，单位为微克每毫升（μg/mL）；K—试样稀释倍数。
5.7.2结果表示
以两个平行试样测定结果的算术平均值报告结果。5.8质量控制
5.8.1灵敏度
各氨基酸信噪比应大于10。
5.8.2空白分析
...·（2）
每次分析至少做一个实验室空白，实验室空白中检出每个目标化合物的浓度不得超过方法的检出限。
5.8.3校准
每批样品应绘制标准曲线，相关系数应≥0.995，否则应重新绘制标准曲线。每20个样品或每批次样品（少于20个样品）应测定一个标准曲线中间浓度点标准溶液，其测定结果与该点浓度的相对偏差应≤20%，否则应重新绘制标准曲线，5.8.4平行样测试
每个样品需做平行双样，平行双样测定结果的相对偏差应≤20%。6方法三：高效液相色谱柱前衍生法6.1原理
-级氨基酸，在巯基试剂存在下，首先与邻苯二醛（OPA)反应，生成OPA-氨基酸；反应完毕后，加入9-荡甲基氯甲酸甲酯（FMOC），剩余的二级氨基酸与FMOC继续反应，生成FMOC-氨基酸，两次反应生成的氨基酸衍生物经反相高效液相色谱分离后用紫外检测器（或荧光检测器）检测，在一定范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。注：本方法可使用市售在线衍生试剂盒，通过高效液相色谱进行测试。6.2试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。6.2.1流动相A：称取十二水合磷酸氢二钠9.0g，十水合四硼酸钠9.5g，加水2000mL，用盐酸rKaeerkAca-
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调pH至8.2。
6.2.2流动相B：取甲醇450mL，乙450mL，水100mL，混匀。6.2.30.4mol/L硼酸盐缓冲液（pH10.2）：取硼酸24.73g，加水800mL溶解，用40%氢氧化钠溶液调pH至10.2，然后加水稀释至1000mL。6.2.4邻苯二甲醛溶液：取邻苯二甲醛80mg，乙酰半胱氨酸97mg，加0.4mol/L硼酸盐缓冲液(pH10.2)7mL，加乙腈1mL溶解。6.2.5荔代甲氧基酰氯溶液：取荔代甲氧基酰氯40mg，加乙腈8mL溶解。6.2.6
稀释液：取流动相A100mL，加磷酸0.5mL，混匀。6.2.70.1mol/L盐酸溶液：取盐酸9mL，加水适量使成1000mL，摇匀。6.2.80.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，加新沸过的冷水使成1000mL，摇匀。6.2.919种氨基酸对照品：国家（或国际）标准品或可量值溯潮源的对照品。6.3
氨基酸对照品溶液配制
6.3.1氨基酸对照品储备液
分别取氨基酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液解并定容至刻度，制成氨基酸对照品储备液。称取L-色氨酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加少许水和数滴0.1mol/L氢氧化钠，使之溶解，加水定容至刻度。6.3.2混合氨基酸对照品系列溶液移取单个氨基酸对照品储备液适量，置于同一容量瓶中，加水稀释配制成混合氨基酸对照品储备液。将混合氨基酸对照品储备液稀释，配制成混合氨基酸对照品系列溶液，使各氨基酸浓度在1ug/mL~100μg/mL范围。
6.4仪器
电子天平，精度为0.0001g。
6.4.2高效液相色谱仪。
6.4.3高速离心机。
6.4.4涡旋振荡器。
6.5试样制备
精密移取一定量样品，加水稀释至各氨基酸浓度在1μg/mL～100μg/mL范围。样品中如含有蛋白质，取样品1mL，加1mL4%磺基水杨酸，混匀后，9500g离心10min，取上清液作为待测液备用。若上清液中各氨基酸浓度不在1μg/mL～100μg/mL范围，应用水将浓度稀释至该范围。
6.6分析步骤
6.6.1高效液相色谱仪参考条件
色谱柱：填料为粒径3μm十八烷基硅烷键合硅胶，柱长为15cm、柱内径为4.6mm的色谱柱。6.6.1.1
6.6.1.2柱温：50℃。
检测波长：338nm（一级氨基酸），262nm（二级氨基酸）［如使用荧光检测器检测，激发波长6.6.1.3
340nm，发射波长450nm（一级氨基酸）；激发波长266nm，发射波长305nm（二级氨基酸）」。6.6.1.4梯度洗脱条件：见表3。8
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时间/min
流动相梯度洗脱程序
流动相A/%
流动相B/%
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流速/（mL/min）
注：由于各实验室HPLC仪器管路内径、长度及流通池体积大小的差异，提供的梯度洗脱条件仅供参考，请根据仪器实际情况调整梯度洗脱条件。6.6.2测定
精密量取对照品溶液50μL，置于5mL塑料离心管中，精密加人0.4mol/L硼酸盐缓冲液（pH10.2）250μL，混勾，精密加邻苯二甲醛溶液50μL，混勾，放置30s，精密加人代甲氧基酰氯溶液50μL，混匀，放置30s，精密加稀释剂1.6mL，精密量取40μL，注人液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液40μL同法处理后测定。结果计算与表示
样品中各氨基酸含量
样品中各氨基酸含量按式（3)计算：X,=C,×K
式中：
X，——样品中各氨基酸i含量，单位为微克每毫升(μg/mL)；C
根据回归方程计算样品测定液中氨基酸i含量，单位为微克每毫升（μg/mL）；K
试样稀释倍数。
结果表示
以两个平行试样测定结果的算术平均值报告结果。6.8
质量控制
6.8.1分离度
各氨基酸间的分离度均大于1.5。-rrKaeerkAca-
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空白分析
每次分析至少做一个实验室空白，实验室空白中检出每个目标化合物的浓度不得超过方法的检出限。
6.8.3校准
每批样品应绘制标准曲线，相关系数应≥0.995，否则应重新绘制标准曲线每20个样品或每批次样品（少于20个样品）应测定一个标准曲线中间浓度点标准溶液，其测定结果与该点浓度的相对偏差应≤20%，否则应重新绘制标准曲线，平行样测试
每个样品需做平行双样，平行双样测定结果的相对偏差应≤20%。10
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中华人民共和国医药行业标准
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人类辅助生殖技术用医疗器械
培养用液中氨基酸检测方法
Medical devices for human assisted reproductive technology-Determination of amino acids in human assisted reproductive media2020-03-31发布
国家药品监督管理局
2021-04-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。YY/T1695—2020
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家药品监督管理局提出。本标准由中国食品药品检定研究院归口。本标准起草单位：中国食品药品检定研究院。本标准主要起草人：柯林楠、黄元礼、赵丹妹、方玉、韩倩倩、王春仁、段晓杰。I
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1范围
人类辅助生殖技术用医疗器械
培养用液中氨基酸检测方法
YY/T1695—2020
本标准规定了用氨基酸分析仪法、高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪法、高效液相色谱柱前衍生法检测人类辅助生殖技术用培养用液中氨基酸成分。本标准适用于人类辅助生殖技术用培养用液中所含甘氨酸（GLY)、亮氨酸（LEU)、蛋氨酸（MET)、酪氨酸（TYR）、组氨酸（HIS）、苏氨酸（THR）、丙氨酸（ALA）、异亮氨酸（ILE）、色氨酸（TRY）、胱氨酸（CYS)、赖氨酸（LYS）、天门冬氨酸（ASP）、缬氨酸（VAL）、苯丙氨酸（PHE）、脯氨酸(PRO)、丝氨酸（SER）、谷氨酸（GLU)、精氨酸（ARG)、牛磺酸（TAU)19种氨基酸的定量分析。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法JJG1064—2011氨基酸分析仪检定规程YY/T0995人类辅助生殖技术用医疗器械术语和定义3术语和定义
YY/T0995界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1
氨基酸分析仪法amino acidanalyzer氨基酸分析仪中离子交换色谱柱将样品中不同的氨基酸分离，并以节三酮做柱后衍生后，在570nm和440nm波长下测定，以外标法进行定量。3.2
高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪法high-performanceliquidchromatographycoupledtotandemmassspectrometry
高效液相色谱将样品中的待测成分初步分离开，三重四级杆质谱仪对分开的待测成分通过筛选母离子质核比得到待测离子，待测离子经碰撞后碎裂成子离子，最后通过子离子的碎片强度定量待测成分。
高效液相色谱柱前衍生法high-performanceliquidchromatographypre-columnderivatizationandanalysismethod
待测组分先通过衍生化反应，转化为衍生化产物，然后经过色谱柱与样品中的其他组分分离，再通过外标法进行定量。
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4方法一：氨基酸分析仪法（仲裁法）4.1原理
不同氨基酸有不同的色谱表现，通过氨基酸分析仪的离子交换色谱柱分离后，以节三酮做柱后衍生后进行测定，以外标法定量。
注：氨基酸分析仪法测定含有二肽，如丙氨酰-谷氨酰胺等培养用液时，胱氨酸(CYS)定量会受到培养用液中二肽的干扰，不适宜采用该法。bZxz.net
4.2试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。4.2.1不同pH和离子强度的洗脱用柠檬酸锂缓冲液：按仪器使用说明书配制或购买。4.2.2节三酮溶液：按仪器使用说明书配制或购买4.2.34%磺基水杨酸溶液：称取磺基水杨酸4g，加水稀释至100mL。4.2.4
0.1mol/L盐酸溶液：取盐酸9mL，加水适量使成1000mL，摇匀。4.2.50.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，加新沸过的冷水使成1000mL，摇匀。4.2.619种氨基酸对照品：国家（或国际）标准品或可量值溯源的对照品。4.3对照品溶液配制
氨基酸对照品储备液
分别取氨基酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液溶解并定容至刻度，制成氨基酸对照品储备液。称取L-色氨酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加少许水和数滴0.1mol/L氢氧化钠，使之溶解，加水定容至刻度。4.3.2混合氨基酸对照品系列溶液吸取单个氨基酸对照品储备液适量，置于同一容量瓶中，加水稀释配制成混合氨基酸对照品储备液。将混合氨基酸对照品储备液稀释，配制成混合氨基酸对照品系列溶液，使各氨基酸浓度在1μg/mL～100μg/mL范围。4℃冰箱保存一周。4.4仪器
4.4.1电子天平，精度为0.0001g。4.4.2氨基酸分析仪。
4.4.3高速离心机。
4.4.4涡旋振荡器。
试样制备
精密移取一定量样品，加水稀释至各氨基酸浓度在1μg/mL～100μg/mL范围。样品中如含有蛋白质，取样品0.5mL，加0.5mL4%磺基水杨酸，混匀后，9500g离心10min，取上清液备用。若上清液中各氨基酸浓度不在1μg/mL～100μg/mL范围，应用水将浓度稀释至该范围。
4.6分析步骤
4.6.1仪器调试
使用混合氨基酸对照品系列溶液注氨基酸分析仪，参照JJG1064一2011《氨基酸分析仪检定规2
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程》及仪器说明书，适当调整仪器操作程序及参数和洗脱用缓冲溶液试剂配比，确认仪器操作条件。4.6.2测试
在上述测试条件下，取混合氨基酸对照品系列溶液和样品溶液（或供试液）20μL，分别注入氨基酸分析仪，以各氨基酸对照品峰面积为纵坐标，氨基酸对照品浓度为横坐标，绘制各氨基酸标准曲线，计算回归方程。
4.7结果计算与表示
4.7.1样品中各氨基酸含量
样品中各氨基酸含量按式(1)计算：X,=C, XK
式中：
X，—样品中氨基酸i含量，单位为微克每毫升（μg/mL)；C，一—根据回归方程计算样品测定液中氨基酸i含量，单位为微克每毫升（μg/mL)；K试样稀释倍数。
4.7.2结果表示
以两个平行试样测定结果的算术平均值报告结果。4.8质量控制
4.8.1分离度
各氨氮基酸分离度≥85%。
4.8.2空白分析
每次分析至少做一个实验室空白，实验室空白中检出每个目标化合物的浓度不得超过方法的检出限。
4.8.3校准
每批样品应绘制标准曲线，相关系数应≥0.995，否则应重新绘制标准曲线。每20个样品或每批次样品（少于20个样品）应测定一个标准曲线中间浓度点标准溶液，其测定结果与该点浓度的相对偏差应≤15%，否则应重新绘制标准曲线，4.8.4平行样测试
每个样品需做平行双样，平行双样测定结果的相对偏差应15%。5方法二：高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪法5.1原理
通过乙睛沉淀人类辅助生殖技术用培养用液中的蛋白质，离心取得上清液后，通过高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪分离检测，根据保留时间及特征离子质核比定性，外标法定量。3
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5.2试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。5.2.1乙腈，色谱纯。
5.2.2甲酸，色谱纯。
5.2.30.1mol/L盐酸溶液取盐酸9mL，加水适量使成1000mL，摇匀。5.2.40.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，加新沸过的冷水使成1000mL，摇勾。5.2.519种氨基酸对照品：国家（或国际）标准品或可量值溯源的对照品。氨基酸对照品溶液配制
5.3.1氨基酸对照品储备液
分别取氨基酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液溶解并定容至刻度，制成氨基酸对照品储备液。称取L-色氨酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加少许水和数滴0.1mol/L氢氧化钠，使之溶解，加水定容至刻度。5.3.2混合氨基酸对照品系列溶液移取单个氨基酸对照品储备液适量，置于同一容量瓶中，加空白溶液（与待测样品基质相同，但不含氨基酸及蛋白）稀释配制成混合氨基酸对照品储备液。将混合氨基酸对照品储备液空白溶液稀释，配制成混合氨基酸对照品系列溶液，使各氨基酸浓度在0.05μg/mL～1μg/mL范围。5.4仪器
5.4.1高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪，配电喷雾离子化源（ESI)。5.4.2电子天平，精度为0.0001g。5.4.3高速离心机。
5.4.4涡旋振荡器。
5.5试样制备
精密移取一定量样品，加水稀释至各氨基酸浓度在0.05μg/mL～1μg/mL范围。样品中如含有蛋白质，取样品100μL，加200μL乙，涡旋混匀后，9500g离心10min，取上清液备用。若上清液中各氨基酸浓度不在0.05μg/mL~1μg/mL范围，应用水将浓度稀释至该范围。5.6分析步骤
5.6.1仪器参考条件
5.6.1.1高效液相色谱仪参考条件高效液相色谱仪参考条件如下：色谱柱：填料为3μm五氟苯基柱，柱长150mm、内径2.1mm的色谱柱或其他性能相似的色a)
谱柱。
流动相：A为100%水（含0.1%甲酸溶液）；B为100%乙腈（含0.1%甲酸溶液）。b）
流速：0.35mL/min。
柱温：40℃。
进样量：1.0μL。
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梯度洗脱程序见表1。
时间/min
流动相梯度洗脱程序
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流动相B比例/%
对不同色谱柱及液相，洗脱程序可能存在差异，测定前宜将程序优化到最佳5.6.1.2
质谱仪参考条件
质谱仪参考条件如下：
离子源：电喷雾离子源；
离子检测方式：多反应监测；
离子源接口电压：-3.0kV；
雾化气：氮气，3.0L/min；
干燥气：氮气，10L/min；
加热气：空气，10L/min；
碰撞气：氩气；
脱溶剂管温度：250℃；
加热模块温度：400℃；
接口温度：300℃。
19种氨基酸的质谱分析条件参数见表2。19种氨基酸的质谱分析参数”
氨基酸名称
甘氨酸
丙氨酸
脯氨酸
丝氨酸
缬氨酸
定量离子/（m/z）
75.90>30.15
89.90>44.10
116.0>70.15
105.90>60.10
118.00>57.10
离子极性
正离子
正离子
正离子
正离子
正离子
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Q1Prerod
bias/V
Q3Prerod
bias/v
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氨基酸名称
苏氨酸
亮氨酸
异亮氨酸
天冬氨酸
赖氨酸
谷氨酸
甲硫氨酸
组氨酸
苯丙氨酸
精氨酸
酪氨酸
胱氨酸
色氨酸
牛磺酸
定量离子/(m/z）
120.10>74.15
132.10>30.05
132.10>69.15
134.00>74.05
147.20>130.10
147.90>84.10
149.90>56.10
155.90>110.10
166.10>103.10
175.20>60.10
182.10>136.10
241.00>73.90
205.10>188.15
124.15>79.90
表2(续）
离子极性
正离子
正离子
正离子
正离子
正离子
正离子
正离子
正离子
正离子
正离子
正离子
正离子
正离子
负离子
Q1Prerod
bias/v
对不同质谱仪，参数可能存在差异，测定前宜将质谱参数优化到最佳。5.6.1.3
仪器调谐
Q3Prerod
bias/v
按照仪器使用说明书在规定时间和频次内对高效液相色谱串联质谱仪进行仪器质量数和分辨率校正，其中仪器质量数偏移在士0.5Da之内，质谱峰半峰宽在0.6Da～0.9Da，以确保仪器处于最佳测试状态。
注：Da，道尔顿(Dalton)的缩写，指以人名命名的原子质量单位。5.6.2测试
在上述测试条件下，取混合氨基酸对照品系列溶液和样品溶液（或供试液）1μL，分别注人仪器，以6
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各氨基酸对照品峰面积为纵坐标，氨基酸对照品浓度为横坐标，绘制各氨基酸标准曲线，计算回归方程。5.7结果计算与表示
5.7.1样品中各氨基酸含量
样品中各氨基酸含量按式（2)计算：X,=C,XK
式中：
X：—样品中各氨基酸i含量，单位为微克每毫升（μg/mL)；C，一根据回归方程计算样品测定液中氨基酸i含量，单位为微克每毫升（μg/mL）；K—试样稀释倍数。
5.7.2结果表示
以两个平行试样测定结果的算术平均值报告结果。5.8质量控制
5.8.1灵敏度
各氨基酸信噪比应大于10。
5.8.2空白分析
...·（2）
每次分析至少做一个实验室空白，实验室空白中检出每个目标化合物的浓度不得超过方法的检出限。
5.8.3校准
每批样品应绘制标准曲线，相关系数应≥0.995，否则应重新绘制标准曲线。每20个样品或每批次样品（少于20个样品）应测定一个标准曲线中间浓度点标准溶液，其测定结果与该点浓度的相对偏差应≤20%，否则应重新绘制标准曲线，5.8.4平行样测试
每个样品需做平行双样，平行双样测定结果的相对偏差应≤20%。6方法三：高效液相色谱柱前衍生法6.1原理
-级氨基酸，在巯基试剂存在下，首先与邻苯二醛（OPA)反应，生成OPA-氨基酸；反应完毕后，加入9-荡甲基氯甲酸甲酯（FMOC），剩余的二级氨基酸与FMOC继续反应，生成FMOC-氨基酸，两次反应生成的氨基酸衍生物经反相高效液相色谱分离后用紫外检测器（或荧光检测器）检测，在一定范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。注：本方法可使用市售在线衍生试剂盒，通过高效液相色谱进行测试。6.2试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。6.2.1流动相A：称取十二水合磷酸氢二钠9.0g，十水合四硼酸钠9.5g，加水2000mL，用盐酸rKaeerkAca-
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调pH至8.2。
6.2.2流动相B：取甲醇450mL，乙450mL，水100mL，混匀。6.2.30.4mol/L硼酸盐缓冲液（pH10.2）：取硼酸24.73g，加水800mL溶解，用40%氢氧化钠溶液调pH至10.2，然后加水稀释至1000mL。6.2.4邻苯二甲醛溶液：取邻苯二甲醛80mg，乙酰半胱氨酸97mg，加0.4mol/L硼酸盐缓冲液(pH10.2)7mL，加乙腈1mL溶解。6.2.5荔代甲氧基酰氯溶液：取荔代甲氧基酰氯40mg，加乙腈8mL溶解。6.2.6
稀释液：取流动相A100mL，加磷酸0.5mL，混匀。6.2.70.1mol/L盐酸溶液：取盐酸9mL，加水适量使成1000mL，摇匀。6.2.80.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，加新沸过的冷水使成1000mL，摇匀。6.2.919种氨基酸对照品：国家（或国际）标准品或可量值溯潮源的对照品。6.3
氨基酸对照品溶液配制
6.3.1氨基酸对照品储备液
分别取氨基酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液解并定容至刻度，制成氨基酸对照品储备液。称取L-色氨酸对照品适量至容量瓶中，精密称定，加少许水和数滴0.1mol/L氢氧化钠，使之溶解，加水定容至刻度。6.3.2混合氨基酸对照品系列溶液移取单个氨基酸对照品储备液适量，置于同一容量瓶中，加水稀释配制成混合氨基酸对照品储备液。将混合氨基酸对照品储备液稀释，配制成混合氨基酸对照品系列溶液，使各氨基酸浓度在1ug/mL~100μg/mL范围。
6.4仪器
电子天平，精度为0.0001g。
6.4.2高效液相色谱仪。
6.4.3高速离心机。
6.4.4涡旋振荡器。
6.5试样制备
精密移取一定量样品，加水稀释至各氨基酸浓度在1μg/mL～100μg/mL范围。样品中如含有蛋白质，取样品1mL，加1mL4%磺基水杨酸，混匀后，9500g离心10min，取上清液作为待测液备用。若上清液中各氨基酸浓度不在1μg/mL～100μg/mL范围，应用水将浓度稀释至该范围。
6.6分析步骤
6.6.1高效液相色谱仪参考条件
色谱柱：填料为粒径3μm十八烷基硅烷键合硅胶，柱长为15cm、柱内径为4.6mm的色谱柱。6.6.1.1
6.6.1.2柱温：50℃。
检测波长：338nm（一级氨基酸），262nm（二级氨基酸）［如使用荧光检测器检测，激发波长6.6.1.3
340nm，发射波长450nm（一级氨基酸）；激发波长266nm，发射波长305nm（二级氨基酸）」。6.6.1.4梯度洗脱条件：见表3。8
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时间/min
流动相梯度洗脱程序
流动相A/%
流动相B/%
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流速/（mL/min）
注：由于各实验室HPLC仪器管路内径、长度及流通池体积大小的差异，提供的梯度洗脱条件仅供参考，请根据仪器实际情况调整梯度洗脱条件。6.6.2测定
精密量取对照品溶液50μL，置于5mL塑料离心管中，精密加人0.4mol/L硼酸盐缓冲液（pH10.2）250μL，混勾，精密加邻苯二甲醛溶液50μL，混勾，放置30s，精密加人代甲氧基酰氯溶液50μL，混匀，放置30s，精密加稀释剂1.6mL，精密量取40μL，注人液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液40μL同法处理后测定。结果计算与表示
样品中各氨基酸含量
样品中各氨基酸含量按式（3)计算：X,=C,×K
式中：
X，——样品中各氨基酸i含量，单位为微克每毫升(μg/mL)；C
根据回归方程计算样品测定液中氨基酸i含量，单位为微克每毫升（μg/mL）；K
试样稀释倍数。
结果表示
以两个平行试样测定结果的算术平均值报告结果。6.8
质量控制
6.8.1分离度
各氨基酸间的分离度均大于1.5。-rrKaeerkAca-
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空白分析
每次分析至少做一个实验室空白，实验室空白中检出每个目标化合物的浓度不得超过方法的检出限。
6.8.3校准
每批样品应绘制标准曲线，相关系数应≥0.995，否则应重新绘制标准曲线每20个样品或每批次样品（少于20个样品）应测定一个标准曲线中间浓度点标准溶液，其测定结果与该点浓度的相对偏差应≤20%，否则应重新绘制标准曲线，平行样测试
每个样品需做平行双样，平行双样测定结果的相对偏差应≤20%。10
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