YY/T 1649.2-2019.Test method for interactions of medical devices with platelet-Part 2: In vitro platelet activation products (B-TG，PF4 and TxB2) assay.
1范围
YY/T1649的本部分规定了在体外对医疗器械/材料进行血液相容性评价时,医疗器械/材料与血小板相互作用的体外血小板激活试验方法。本标准适用于医疗器械/材料表面血小板粘附性能和激活潜能的评价。
YY/T 1649.2中建立的试验体系适用于人血。若使用动物血液，可在论证其适宜性的基础.上进行试脸。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注8期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件.其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分:风险管理过程中的评价与试验
GB/T 1886.4医疗 器械生物学评价第 4部分:与血液相互作用试验选择
GB/T 1886.12医疗 器械生物学评价第12部分:样品制备与参照材料
3术语和定义
GB/T 1886.1 .GB/T 1886.4 .GB/T 16886.12界定的术语和定义适用于本文件。
4概述
当医疗器械/材料与人血接触后，血液中颗粒物质的开高可能是医疗器械/材料引起或促进出血或血栓形成的诱因。如果血小板颗粒物质与对照相比显著升高,则表明医疗器械/材料有激活血小板的潜能。常见的血小板颗粒物质主要包括F-血栓球蛋白(B-TG).血小板第4因子(PF4)和血栓素B2(TxB2)等。
5试验原理(以B-TG为例)
ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人B-TG水平。用纯化的B-TG抗体包被微孔板.制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加人9-TG.再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的B-TG抗体结合。.形成抗体抗原酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物四甲基联苯胶(TMB)显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的B-TG呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人ρ-TG浓度.

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中华人民共和国医药行业标准
YY/T1649.2—2019
医疗器械与血小板相互作用试验第2部分：体外血小板激活产物
（-TG、PF4 和TxB2）的测定
Test method for interactions of medical devices with platelet-Part 2: In vitro platelet activation products (β-TG. PF4 and TxB2) assay2019-10-23 发布
国家药品监督管理局
2020-10-01实施
YY/T1649《医疗器械与血小板相互.作用试验》.包括以下部分：第1部分：体外血小板计数法；
第2部分：体外血小板激活产物（3TG、PF4和TxB2）的测定本部分为YY/T【649的第2部分。本部分按照GB/T1.12009给出的舰则起草YY/T 1649.2—2019
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家药品监督督理局提出：本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会（SAC/TC248)归口本部分起草单位：山东省医疗器械产品质量检验中心、四川人学（四川医疗器械生物材料和制品检验中心）。
本部分主要起草人：乔春霞、干国伟、袁、梁洁、郑利萍。YY/T1649.2—2019
对血小板及其激活状态的评价有许多方法，但与血液接触的医疗器械和材料的评价最常用的方法是简单的血小板计数法和血小板颗粒物质的释放法。YY/T1649的本部分是体外血小板激活试验的其体试验方法.可作为GB/T16886.4中医疗器械/材料与血小板朴互作用评价的补充，作为血液的重要组分，血小板对于防止出血起关键作用，接触器械/材料后血液中血小板颗粒物质的升高，表明血小板被激活，将直接影响医疗器械/材料的而血液相容性。YY/T1649的本部分所描述的体外血小板激活产物的测定方法，可用来评价医疗器械/材料刘血小板潜在的粘附和激活作用。1范围
医疗器械与血小板相互作用试验第2部分：体外血小板激活产物
（β-TG、PF4 和 TxB2 ）的测定YY/T1649.2—2019
YYT1649的本部分规定了在体外对医疗器械/材料进行血液相容性评价时，医疗器械/材料与小板相五作用的体外血小板激活试验方法。本标准适用于医疗器械/材料表面血小板粘附性能和激活潜能的评价，
本部分中建立的试验体系适用于人血。若使用动物血液，可在论证其适宜性的基础「进行试验。2规范性引用文件
下列文件对丁本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用丁本文件。凡是不注Ⅱ期的引用文件.其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T16886.1医疗器械牛物学评价第1部分：风险管埋过程巾的评价与试验GB/T16886.4医疗器械生物学评价第4部分：与血液相五作用试验选择GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照材料3术语和定义
([3/T【6886.GB3/T16886.1、13/T16886.12界定的术语和定义适用于本文件。4概述
当医疗器械/材料与人血接触后，血液中颗粒物质的升高可能是医疗器械/材料引起或促进出血或血栓形成的诱因：如果血小板颗粒物质与对照相比显著升高，则表明医疗器械/材料有波活血小板的潜能。常见的血小板颗粒物质要包括3-血栓球蛋白（9-TG）、血小板第4因了（PF4）和血栓索B2(TxB2)等.
5试验原理（以β-TG为例）
EIL.ISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人B-TG水平。用纯化的3-TG抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加人B-TG,再与棘根过氧化物酶(HRP)标记的β-T(抗体结合-形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物四甲基联米胺（TMB)显色，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的βTG呈正朴关用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（()）值），通过标准曲线计算样品中人3-TG浓度。1
YY/T1649.2—2019
6试剂和材料
6.1试剂
6.1.1人3 TG、PF4和TxB2 ELISA试剂盒,应出有资质的供应商提供并经过验证6.1.2新鲜健康抗凝人全血
注1：为了防止穿则时引起的血小板激活，采集的第一管血推荐奔之不用，建议采集的血液在4h之内使川。试验结束后按相关规定处理血液及血液接触后的物品注2：为广排除落而引起的干扰，可以考虑选择富而小板而浆（P尺P)进行试验，并对适亢性进行验证6.2试验对照
6.2.1阴性对照例如：高密度聚乙烯（HIDPE)1，6.2.2阳性对照（例如：胶原蛋门、凝血酶、壳聚糖、ALP等）：6.2.3空户对照（术接触材料的血液）注1：一种材料或试剂往往片不能同时诱导所有颗精蛋自产牛用性结果，因此各实验率可以根据实际情况选择适合的阳性对照，如胶原蛋自和凝而酶可能诱导PF4和TxI2的释放·壳聚糖及适当剂量的AIP可能透宁3-「（的释放。本部分中的阴性对照和阳性对照仅为推荐，使用者对所选择试验对照的适用性进行确认后，可根据实验率实际情况选择适宜的对照，注2：如需要时，可选择已上市的同类医疗幕械作为对照样品，7仪器和试验器具
酶标仪、恒温培养箱、水浴摇床、离心机和制冰机等带盖试管。如试管的材料是促血栓形成的（如玻璃），则会对试验产生潜在的十扰。因此-推荐使7.2
用聚艺烯或聚丙烯材质试管。
7.3血液采集管。含3.2%（0.109mol/1.)椅檬酸钠或参照试剂盒要求选用合适的采血管。移液管（非玻璃管）。
8样品制备
剩备试验样品阴性对照、阳性对照和对照样品（如选择），各平行3份，按GB/T16886.12的要求制备试验样品，将样品或材料剪成小块以保证血液能完全接盖试验样品：空门对照同时平行制备3份注：增加接触比例理论上会增加测试材料对血小板激活反应的敏感性，可采川H他接触比例如GB/T16886.12拥荐的接触比例的1.5倍或.0倍，加以说明并阅述理出后，可采用其他模拟临床使川或能对潜在您害进行适当测定的比例。
9试验步骤
9.1抗凝人全血，颠倒混匀后室温保存备用。9.2将诚验样品、阴性对照、阳性对照和对照样品（如选择）放入试管中，接比例在每支试管中加人全血。空白对照为未接触材料的血液。川选择在接触血液前，用相同比例的0.9%氯化钠注射液预湿每试管中的材料，室温静置30s.加入血液前移除所有0.9%氯化钠注射液，每组平行3管。9.3所有试管在（37工1）℃的水浴中震荡孵育（60工5)min.适宜的转速为60r/min。9,4孵育1 h 后,每个试管中加入终浓度为 5 mmol/L的EDTA来终止反应。通常是在 1.0 mL的人2
全血中加人0.0lml.的EDTA500mmol/1.)米达到适亢的终浓度。YY/T1649.2—2019
9.5轻轻混合每一诚管，转移全部血液至刃一相应标记的试管中，于1500g离心0min，取「层贫而小板血浆(PPP)用丁检测：也川以根据试剂盒要求制备和保存血浆，9.6按试剂盒说明书进行操作。
注：根据实际情况，可能需要将检测样品进行适当稀释。10结果计算
10.1根据诚剂盒要求绘制标准曲线，计算值和拟合曲线的方程式，10.2计算每管中血小板颗粒物质的含量。10.3分别计算3管试验样品、阴性对照、阳性对照、空立对照和对照样品（如选择）的血小板颗粒物质含量的平哟值
10.4阳性对照和试验样品中血小板颗精物质的含量与阴性对照或对照样品（如选择)的含量迹行统计学分析，p0.05为具有统计学意义10.5试验样品、阴性对照和阳性对照的平均值除以空白对照的平均值或已「市对照样品（如选择)的平均值按式（1)计算与空白刘照或对照样品（如选择）的白分比：A
式中：
C一一试验样品、阴性对照、阳性对照与空对照/对照样品（如选择)杆比的百分比，%A
试验样品，阴性对照、研性对照而小板颗粒物质含量平均值：空白刘照/对照样品(如选择)的颗粒蛋白含量平均值。11
试验有效性
相关指标应符合试剂盒的要求
11.2阳性对照的含量应高于阴性对照，且差另具有统计学意义（p0.05）。11.3阴性对照与空白对照相比的自分数应作80%120%范用内。12
结果评价
12.1如来用统计学分析迹行结束评价，试验样品应与空白对照或阴性刘照进行比较，如差异有统计学意义·则与口上市器械进行比较有助于判断试验样品的结果是否可接受。12.2如采用百分比进行结果评价，诚验样品与空白对照相比的百分比应在80%-120%范国内，如证验样品与空方对照相比的百分比小于80%或大于120%.则与已上市器械进行比较有助于判断试验样品的结果是否可接受，
12.3所有生物材料部有可能对所接触的血液中血小板生影响。与生物材料接触的血液中β-TG、PF4及TxB2H中有一种或儿种颗精物质显荠性升高可能预小者血小板的激活.3试验报告
试验报告成至少包含以下信息：a）试验样品的描述；
YY/T1649.2—2019
阴性对照、阳性对照、对照样品（如选择)的描述诚剂盒信息；
试验步骤：
结果记录；
试验结果；
结果评价。
参考文献
YY/T1649.2—2019
L1 ASTM F2888 13: Standard Test Method for Platelet Leukocyte Count-An In Vitro Measure forIemocompatibilityAssessment of Cardiovascular MaterialsYY/T 1649.2-2019
中华人民共和国医药
行业标准
医疗器械与血小板相互作用试验第2部分：体外血小板激活产物
(β-TG、PF4 和 TxB2）的测定
YY/T 1649.2—2019
中国标准出版社出版发行
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2019年12月第版
书号：155066：2-34422
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