YY/T 0606.15-2014
基本信息
标准号： YY/T 0606.15-2014
中文名称：组织工程医疗产品 第15部分:评价基质及支架免疫反应的试验方法:淋巴细胞增殖试验
标准类别：医药行业标准(YY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 组织 工程 医疗 产品 评价 支架 免疫 反应 试验 方法 淋巴细胞 增殖
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
YY/T 0606.15-2014.Tissue engineered medical products-Part 15 :Standard practice for evaluation of immune responses of substrate and scaffolds products :Lymphocyte proliferation tests.
1范围
YY/T 0606的本部分规定了评价组织工程医疗产品基质或支架所致哺乳动物细胞免疫反应的试验方法:淋巴细胞增殖试验。
YY/T 0606.15适用于组织工程医疗产品基质或支架的生物学评价。
注:本部分所述试验虽然也可以用于人体标本的检测或用于研究目的,并可为临床追踪提供数据.但并非对人状况的诊断性检测。
除YY/T 0606.15所选方法外,可采纳其他等效方法。并非所有的材料和应用均需要按照本部分进行检测,因此应仔细考虑本部分中方法的适用性。在实施本部分推荐的试验前.应考虑GB/T 16886.1或管理部门所推荐的试验结果所提示的信息。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注8期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 16886.1医疗器械生物学评价 第1部分:风险管理过程中的评价与试验
GB/T 16886.6医疗器械生物学评价第6部分:植入后局部反应试验
GB/T 16886.10医疗器械生物学评价 第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验
GB/T 16886.12医疗器械生物学评价 第 12部分:样品制备与参照样品
YY/T 0606.3组织工程医疗产品 第3 部分:通用分类
YY/T 0606.5组织工程医疗产品 第5 部分:基质及支架的性能和测试ISO/TS 10993.20医疗器械生物学评价 第20部分:医疗器械免疫毒理学试验原则和方法(Bio-logical evaluation of medical devices- Part 20:Principles and methods for immunotoxicology testing of medical devices)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
基质substrate组织工程医疗产品中作为细胞或生物分子生长、支持或输送载体的原材料。
3.2
支架scaffold促进替代.修复或再生组织的细胞或生物活性因子迁移、结合或输送的支持物.释放载体或基体。
1范围
YY/T 0606的本部分规定了评价组织工程医疗产品基质或支架所致哺乳动物细胞免疫反应的试验方法:淋巴细胞增殖试验。
YY/T 0606.15适用于组织工程医疗产品基质或支架的生物学评价。
注:本部分所述试验虽然也可以用于人体标本的检测或用于研究目的,并可为临床追踪提供数据.但并非对人状况的诊断性检测。
除YY/T 0606.15所选方法外,可采纳其他等效方法。并非所有的材料和应用均需要按照本部分进行检测,因此应仔细考虑本部分中方法的适用性。在实施本部分推荐的试验前.应考虑GB/T 16886.1或管理部门所推荐的试验结果所提示的信息。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注8期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 16886.1医疗器械生物学评价 第1部分:风险管理过程中的评价与试验
GB/T 16886.6医疗器械生物学评价第6部分:植入后局部反应试验
GB/T 16886.10医疗器械生物学评价 第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验
GB/T 16886.12医疗器械生物学评价 第 12部分:样品制备与参照样品
YY/T 0606.3组织工程医疗产品 第3 部分:通用分类
YY/T 0606.5组织工程医疗产品 第5 部分:基质及支架的性能和测试ISO/TS 10993.20医疗器械生物学评价 第20部分:医疗器械免疫毒理学试验原则和方法(Bio-logical evaluation of medical devices- Part 20:Principles and methods for immunotoxicology testing of medical devices)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
基质substrate组织工程医疗产品中作为细胞或生物分子生长、支持或输送载体的原材料。
3.2
支架scaffold促进替代.修复或再生组织的细胞或生物活性因子迁移、结合或输送的支持物.释放载体或基体。
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标准内容
ICS11.040.40
中华人民共和国医药行业标准
YY/T0606.15--2014
组织工程医疗产品
第15部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：淋巴细胞增殖试验
Tissue engineered medical products-Part 15:Standard practice for evaluation of immune responses ofsubstrate and scaffolds products:Lymphocyte proliferation tests2014-06-17发布
国家食品药品监督管理总局
2015-07-01实施
中华人民共和国医药
行业标准
组织工程医疗产品
第15部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：淋巴细胞增殖试验
YY/T0606.15—2014
中国标准出版社出版发行
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）网址spc.net.cn
总编室：(010)64275323
发行中心：（010)51780235
读者服务部：（010)68523946
中国标雁出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销
开本880×12301/16
印张0.5
字数7千字
2014年9月第一版
2014年9月第一次印刷bZxz.net
书号：155066·2-27334定价16.00元由本社发行中心调换
如有印装差错
版权专有
侵权必究
举报电话：（010)68510107
YY/T0606《组织工程医疗产品》已经或计划发布以下部分：第2部分：术语；
-第3部分：通用分类；
第4部分：皮肤替代品（物）的术语和分类：第5部分：基质及支架的性能和测试；第6部分：I型胶原蛋白；
——第7部分：壳聚糖；
第8部分：海藻酸钠；
第9部分：透明质酸钠；
第10部分：修复或再生关节软骨的植人物的体内评价：-第12部分：细胞、组织、器官的加工处理指南；第13部分：细胞自动计数法；
第14部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：ELISA法；第15部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：淋巴细胞增殖试验；第16部分：保存指南；
第17部分：外源性因子评价指南；第18部分：海藻酸盐凝胶固定或微囊化指南；第19部分：修复和替代骨组织植人物骨形成活性的体内评价指南：第20部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：细胞迁移试验；第24部分：可吸收生物材料植人试验评价规范；第25部分：动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法；第26部分：聚合物支架微结构评价指南。本部分为YY/T0606的第15部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。YY/T0606.15—2014
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家食品药品监督管理总局提出。本部分由中国食品药品检定研究院归口。本部分起草单位：中国食品药品检定研究院，本部分主要起草人：方玉、杜晓丹、郭婷婷、杨晓芳、王春仁、昊廷斐。1
1范围
组织工程医疗产品
第15部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：淋巴细胞增殖试验
YY/T0606.15-2014
YY/T0606的本部分规定了评价组织工程医疗产品基质或支架所致哺乳动物细胞免疫反应的试验方法：淋巴细胞增殖试验。
本部分适用于组织工程医疗产品基质或支架的生物学评价。注：本部分所述试验虽然也可以用于人体标本的检测或用于研究目的，并可为临床追踪提供数据，但并非对人体状况的诊断性检测。
除本部分所选方法外，可采纳其他等效方法。并非所有的材料和应用均需要按照本部分进行检测，因此应仔细考虑本部分中方法的适用性。在实施本部分推荐的试验前，应考虑GB/T16886.1或管理部门所推荐的试验结果所提示的信息。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验GB/T16886.6E
医疗器械生物学评价第6部分：植人后局部反应试验GB/T16886.10医疗器械生物学评价第10部分：刺激与退发型超敏反应试验GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品YY/T0606.3组织工程医疗产品第3部分：通用分类YY/T0606.5组织工程医疗产品第5部分：基质及支架的性能和测试ISO/TS10993.20医疗器械生物学评价第20部分：医疗器械免疫毒理学试验原则和方法（Biological evaluation of medical devices-Part 20:Principles and methods for immunotoxicology testing ofmedical devices)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
基质substrate
组织工程医疗产品中作为细胞或生物分子生长、支持或输送载体的原材料。3.2
支架scaffold
促进替代，修复或再生组织的细胞或生物活性因子迁移，结合或输送的支持物、释放载体或基体。1
YY/T0606.15—2014
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
ConA：刀豆球蛋白A
PHA：植物凝集素
RPMI1640：一种专用生长培养基5淋巴细胞增殖试验
5.1原理
抗原刺激淋巴细胞产生各种细胞因子或白介素，这些细胞因子/白介素将激活并刺激淋巴细胞等分化，从而使增殖反应放大。
5.2材料和检测标本
基质/支架（以下统称为材料）或其中的已知成分，以及依据GB/T16886.12制备的材料浸提液均可作为免疫学实验材料。
注：当采用材料浸提液作为免疫学实验材料时应对浸提条件的有效性进行论证。检测标本可以来自于依据GB/T16886.6和GB/T16886.10进行的刺激及致敏试验或植人试验的动物血液、器官和组织或活检标本，也可采用相应的临床追踪的患者血液和活检标本；还可以用各种抗原免疫动物（免或小鼠）获得标本。实验需使用活细胞，可取自外周血、腹腔渗出液、肺泡灌洗液、撕碎或研碎的淋巴器管。
5.3实验设计分组
体外抗原刺激方式
当采用体外抗原刺激方式时可考虑分为以下四组，建议每组至少3支平行管：a)
细胞对照组；
细胞加有丝分裂原（PHA/ConA）：细胞加浓度1抗原（材料或浸提液）；d）细胞加浓度2抗原（材料或浸提液）注：推荐多克隆T细胞刺激原(有丝分裂原)(例如PHA或ConA)作为体外抗原刺激的阳性对照，5.3.21
体内抗原刺激方式
当采用体内抗原刺激方式时，可将实验动物分为：阴性对照组（溶剂空白或手术空白）；a
b）阳性对照组（已知特异性阳性抗原)；c）试验材料组（推荐设三个剂量组）。注：推荐采用已知特异性阳性抗原作为体内抗原（刺激）的阳性对照。5.4推荐操作步骤
5.4.1采用适当的方法分离淋巴细胞（如使用淋巴细胞分离液、红细胞裂解液），并将其悬浮在生长培养基中（RPMI1640，含10%胎牛血清和1%浓度为30mg/mL的谷氨酰胺溶液），调整细胞浓度至2
10″个细胞/mL。
YY/T0606.15—2014
注：试验应在无菌环境下操作。除青霉素/链霉素或庆大霉素外，不建议在培养液中使用其他的抗生素，因为它们的作用模式可能会影响到细胞的反应，5.4.2将淋巴细胞悬液分配到试管中，每个标本至少2支平行管，每管1mL。5.4.3将上述试管置于37℃培养7d，有丝分裂原的反应峰值出现在第4天，抗原的反应峰值出现在第7天。
5.4.4培养7d后，向培养基中加入°H-胸腺嘧啶核苷或1251-胸腺嘧啶核苷继续培养4h～6h。5.4.5收集细胞（通常采用过滤清洗的方法），检测同位素的掺人量。MTT作为一种简便的细胞增殖染色标记，其应用越来越多，也可以用AlamarBlue等上述试验也可采用微孔培养板进行。每个标本至少2个平行孔。建议进行预试验确定培养时间。抗原与有丝分裂原联合使用可用于检测免疫抑制。数据分析
体外抗原刺激
将抗原存在下的同位素掺入量（采用MTT法时为光密度值，采用AlamarBlue时为还原率）与细胞对照组比较。有丝分裂原用于确认检测系统运行是否正常。允许将抗原与有丝分裂原引起的反应进行比较。
6.2体内抗原刺激
将实验组的同位素掺人量（采用MTT法时为光密度值，采用AlamarBlue时为还原率）与阴性对照组比较。已知特异性阳性抗原用于确认检测系统运行是否正常。YY/T0606.15—2014
参考文献
［1]ASTMF1905-98(2003)
Standard PracticeforSelectingTests forDeterminingthePropen-sity of Materials to Cause Immunotoxicity.[2]ASTMF1906-98(2003)StandardPracticeforEvaluation of ImmuneResponses InBio-compatibility Testing Using ELISA Tests,Lymphocyte,Proliferation,and Cell Migration.版权专有
侵权必究
书号：1550662-27334
YY/T0606.15-2014
打印H期：2014年10月22日F009A定价：
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中华人民共和国医药行业标准
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国家食品药品监督管理总局
2015-07-01实施
中华人民共和国医药
行业标准
组织工程医疗产品
第15部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：淋巴细胞增殖试验
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印张0.5
字数7千字
2014年9月第一版
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YY/T0606《组织工程医疗产品》已经或计划发布以下部分：第2部分：术语；
-第3部分：通用分类；
第4部分：皮肤替代品（物）的术语和分类：第5部分：基质及支架的性能和测试；第6部分：I型胶原蛋白；
——第7部分：壳聚糖；
第8部分：海藻酸钠；
第9部分：透明质酸钠；
第10部分：修复或再生关节软骨的植人物的体内评价：-第12部分：细胞、组织、器官的加工处理指南；第13部分：细胞自动计数法；
第14部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：ELISA法；第15部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：淋巴细胞增殖试验；第16部分：保存指南；
第17部分：外源性因子评价指南；第18部分：海藻酸盐凝胶固定或微囊化指南；第19部分：修复和替代骨组织植人物骨形成活性的体内评价指南：第20部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：细胞迁移试验；第24部分：可吸收生物材料植人试验评价规范；第25部分：动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法；第26部分：聚合物支架微结构评价指南。本部分为YY/T0606的第15部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。YY/T0606.15—2014
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家食品药品监督管理总局提出。本部分由中国食品药品检定研究院归口。本部分起草单位：中国食品药品检定研究院，本部分主要起草人：方玉、杜晓丹、郭婷婷、杨晓芳、王春仁、昊廷斐。1
1范围
组织工程医疗产品
第15部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：淋巴细胞增殖试验
YY/T0606.15-2014
YY/T0606的本部分规定了评价组织工程医疗产品基质或支架所致哺乳动物细胞免疫反应的试验方法：淋巴细胞增殖试验。
本部分适用于组织工程医疗产品基质或支架的生物学评价。注：本部分所述试验虽然也可以用于人体标本的检测或用于研究目的，并可为临床追踪提供数据，但并非对人体状况的诊断性检测。
除本部分所选方法外，可采纳其他等效方法。并非所有的材料和应用均需要按照本部分进行检测，因此应仔细考虑本部分中方法的适用性。在实施本部分推荐的试验前，应考虑GB/T16886.1或管理部门所推荐的试验结果所提示的信息。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验GB/T16886.6E
医疗器械生物学评价第6部分：植人后局部反应试验GB/T16886.10医疗器械生物学评价第10部分：刺激与退发型超敏反应试验GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品YY/T0606.3组织工程医疗产品第3部分：通用分类YY/T0606.5组织工程医疗产品第5部分：基质及支架的性能和测试ISO/TS10993.20医疗器械生物学评价第20部分：医疗器械免疫毒理学试验原则和方法（Biological evaluation of medical devices-Part 20:Principles and methods for immunotoxicology testing ofmedical devices)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
基质substrate
组织工程医疗产品中作为细胞或生物分子生长、支持或输送载体的原材料。3.2
支架scaffold
促进替代，修复或再生组织的细胞或生物活性因子迁移，结合或输送的支持物、释放载体或基体。1
YY/T0606.15—2014
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
ConA：刀豆球蛋白A
PHA：植物凝集素
RPMI1640：一种专用生长培养基5淋巴细胞增殖试验
5.1原理
抗原刺激淋巴细胞产生各种细胞因子或白介素，这些细胞因子/白介素将激活并刺激淋巴细胞等分化，从而使增殖反应放大。
5.2材料和检测标本
基质/支架（以下统称为材料）或其中的已知成分，以及依据GB/T16886.12制备的材料浸提液均可作为免疫学实验材料。
注：当采用材料浸提液作为免疫学实验材料时应对浸提条件的有效性进行论证。检测标本可以来自于依据GB/T16886.6和GB/T16886.10进行的刺激及致敏试验或植人试验的动物血液、器官和组织或活检标本，也可采用相应的临床追踪的患者血液和活检标本；还可以用各种抗原免疫动物（免或小鼠）获得标本。实验需使用活细胞，可取自外周血、腹腔渗出液、肺泡灌洗液、撕碎或研碎的淋巴器管。
5.3实验设计分组
体外抗原刺激方式
当采用体外抗原刺激方式时可考虑分为以下四组，建议每组至少3支平行管：a)
细胞对照组；
细胞加有丝分裂原（PHA/ConA）：细胞加浓度1抗原（材料或浸提液）；d）细胞加浓度2抗原（材料或浸提液）注：推荐多克隆T细胞刺激原(有丝分裂原)(例如PHA或ConA)作为体外抗原刺激的阳性对照，5.3.21
体内抗原刺激方式
当采用体内抗原刺激方式时，可将实验动物分为：阴性对照组（溶剂空白或手术空白）；a
b）阳性对照组（已知特异性阳性抗原)；c）试验材料组（推荐设三个剂量组）。注：推荐采用已知特异性阳性抗原作为体内抗原（刺激）的阳性对照。5.4推荐操作步骤
5.4.1采用适当的方法分离淋巴细胞（如使用淋巴细胞分离液、红细胞裂解液），并将其悬浮在生长培养基中（RPMI1640，含10%胎牛血清和1%浓度为30mg/mL的谷氨酰胺溶液），调整细胞浓度至2
10″个细胞/mL。
YY/T0606.15—2014
注：试验应在无菌环境下操作。除青霉素/链霉素或庆大霉素外，不建议在培养液中使用其他的抗生素，因为它们的作用模式可能会影响到细胞的反应，5.4.2将淋巴细胞悬液分配到试管中，每个标本至少2支平行管，每管1mL。5.4.3将上述试管置于37℃培养7d，有丝分裂原的反应峰值出现在第4天，抗原的反应峰值出现在第7天。
5.4.4培养7d后，向培养基中加入°H-胸腺嘧啶核苷或1251-胸腺嘧啶核苷继续培养4h～6h。5.4.5收集细胞（通常采用过滤清洗的方法），检测同位素的掺人量。MTT作为一种简便的细胞增殖染色标记，其应用越来越多，也可以用AlamarBlue等上述试验也可采用微孔培养板进行。每个标本至少2个平行孔。建议进行预试验确定培养时间。抗原与有丝分裂原联合使用可用于检测免疫抑制。数据分析
体外抗原刺激
将抗原存在下的同位素掺入量（采用MTT法时为光密度值，采用AlamarBlue时为还原率）与细胞对照组比较。有丝分裂原用于确认检测系统运行是否正常。允许将抗原与有丝分裂原引起的反应进行比较。
6.2体内抗原刺激
将实验组的同位素掺人量（采用MTT法时为光密度值，采用AlamarBlue时为还原率）与阴性对照组比较。已知特异性阳性抗原用于确认检测系统运行是否正常。YY/T0606.15—2014
参考文献
［1]ASTMF1905-98(2003)
Standard PracticeforSelectingTests forDeterminingthePropen-sity of Materials to Cause Immunotoxicity.[2]ASTMF1906-98(2003)StandardPracticeforEvaluation of ImmuneResponses InBio-compatibility Testing Using ELISA Tests,Lymphocyte,Proliferation,and Cell Migration.版权专有
侵权必究
书号：1550662-27334
YY/T0606.15-2014
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