YY/T 0878.2-2015.Test for complement activation of medical devices-Part 2 :Serum alternative pathway complement activation.
5.1 去纤维蛋白兔RBC和保存在奥尔塞氏(Alsever's)溶液中的绵羊RBC均在4 C条件下储存。绵羊RBC在保存8周后,或第2次洗涤上清中含有肉眼可见血色素(红色)时需丢弃(因为大多数RBC寿命的原因,它们会对补体裂解更敏感,同时自然裂解也增加)。兔RBC比绵羊RBC更易碎,应在保存4周后,或第2次洗涤上清中含有肉眼可见血色素(红色)时丢弃。
注:所有的离心应在4C条件下进行。除了另有说明,所有试剂,试管和细胞制剂都需置于碎冰或冰浴中保持冷状态。
5.2在4C条件下,将5mL绵羊或兔RBC在1000g下离心10min。
5.3将细胞沉淀悬浮于10mL冷BBS-GEDTA中,37C孵育10min.离心并使细胞沉淀重新悬浮于10 mL4 C的BBS-G-EDTA中。
5.4离心细胞， 丢弃上清(洗第1次),细胞沉淀重悬于10 mL冰冷的BBS-GM中(钙缓冲液)或BBSG-EDTA/Mg(镁缓冲液)中(用于吸收血清的细胞用钙缓冲液清洗;用于步骤B检测旁路途径补体消耗的细胞,用镁缓冲液清洗和悬浮)。重复2次(总共洗3次)。
5.5用分 光光度计法对细胞数量进行调节(当浓度为2.0X 10* RBC/mL,波长为412 nm.光程为1.0cm时,1体积清洗后的压积RBC加入24体积BBSGM或BBSGEGTA/Mg.绵羊RBC吸光度为0.75.兔RBC的吸光度为1.30)或用血球计数仪计数。制备10 mL4 C下BBS GM或、BBS G EGTA/Mg中浓度为2.0X10*细胞/mL的细胞悬液。
5.6经过清洗 、稀释的RBC冰上放置,至少可使用12 h.
6血清(补体)的吸收
6.1虽然在血液接触医疗器械材料旁路途径补体激活时,人血清优于豚鼠血清。但有遗传缺陷的人血清却不易获得。用抗体柱吸附法消耗补体成分的人血清不适用于该试验原因有以下两个:
a)特异性成分去除不完全.因此还会存在经典途径激活;和
b)柱材料可激活旁路途径,降低功能性活性。遗传缺陷C4豚鼠来源的血清[C4(-)GPS]没有经典途径补体活性但完全能胜任旁路途径补体激活。在检测生物材料补体激活作用时,虽然滴度不同(与人血清相比,裂解相同兔RBC所需C4(-)GPS)的浓度较大)[5],但C4(->)GPS可与人血清具有相近的生物补体激活效果(见表1中琼脂栅凝胶“举例)。因此,C4(-)GPS适合作为检测人类全血中旁路途径激活的补体成分以及裂解产物的确定性免疫测定的筛选试验。C4(-)GPS适用于从生物公司购买的补体源,通常标记为试剂级补体。
6.2可用绵羊RBC和兔RBC吸收血清以清除自发产生的抗绵羊RBC和抗兔RBC溶血性抗体。
6.2.1将购买的 C4(-)GPS储存于一70 C。
6.2.2将血清在碎冰上解冻或用冰水(如为冻干剂)复溶。

ICS11.040.01
中华人民共和国医药行业标准
YY/T0878.2—2015
医疗器械补体激活试验
第2部分：血清旁路途径补体激活Test for complement activation of medical devices-Part 2:Serum alternative pathway complement activation2015-03-02发布
国家食品药品监督管理总局
2016-01-01实施
YY/T0878《医疗器械补体激活试验》拟分部分出版，目前计划发布如下部分：一第1部分：血清全补体激活；
第2部分：血清旁路途径补体激活；第3部分：血清经典途径补体激活。本部分为YY/T0878的第2部分
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草YY/T0878.2—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家食品药品监督管理总局提出本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会（SAC/TC248）归口。本部分主要起草单位：国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心、国家食品药品监督管理局北京医疗器械质量监督检验中心，国家食品药品监督管理局天津医疗器械质量监督检验中心。本部分主要起草人：乔春霞、王科镭、朱丽丽、姜华、王辉、王蕊I
YY/T0878.2—2015
GB/T16886.4中给出了医疗器械或材料血液相容性试验的选择策略。本部分是体外旁路途径补体激活作用的具体试验方法，可作为GB/T16886.4中医疗器械或材料补体激活试验的补充。YY/T0878.1为固体材料全补体激活试验提供了指南，但是没有区分经典途径和旁路途径。本部分为血液接触固体医疗器械或材料旁路途径补体激活的特异性试验，可用来筛选固体医疗器械或材料潜在的补体激活作用。
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1范围
医疗器械补体激活试验
第2部分：血清旁路途径补体激活YY/T0878.2—2015
YY/T0878的本部分给出了医疗器械体外旁路途径补体激活作用的试验方法。本部分适用于固态样品。
本部分中，“血清”和“补体”可通用，意指将血清用作补体来源。本部分未涉及单一补体成分的功能、修饰或消耗以及来源于血浆的补体。注：非固态样品在使用本方法时，宜确定方法的适用性。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验GB/T16886.4医疗器械生物学评价第4部分：与血液相互作用试验选择YY/T0878.1医疗器械补体激活试验第1部分：血清全补体激活3术语和定义
GB/T16886.1，GB/T16886.4界定的术语和定义适用于本文件。4符号和缩略语
下列符号和缩略语适用于本文件。Ab：抗体（溶血素）（Antibody，hemolysin）BBS：巴比妥缓冲盐（Barbitalbufferedsaline）BBS-G：巴比要缓冲盐-凝胶（Barbitalbufferedsaline-gelatin）BBS-G-EGTA/Mg（MgBuffer）：巴比妥缓冲盐-含EGTA和Mg2+凝胶（镁缓冲液）（Barbitalbuffered saline-gelatin EGTA Mg2+)BBS-GM（CaBuffer）：巴比妥缓冲盐-金属盐凝胶（钙缓冲液）（Barbitalbufferedsaline-gelatinmetals)
C\：补体（Complement)
C4（-）：无C4活性的豚鼠血清（GPSC4-deficientguineapigserum）注：如从遗传学不能产生C4（补体的第4组分）的豚鼠获得的血清。EDTA：乙二胺四乙酸，二钠盐：二水合物（Ethylenediaminetetraaceticacid，disodiumsalt：dihydrate)
EGTA：乙二醇双氨乙基醚四乙酸，四钠盐［Ethyleneglyco-bis（b-aminoethylether)-N，N，N8N8-tetraacetic acid,tetrasodium salt1
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YY/T0878.2—2015
HAGG：热凝集丙种球蛋白（Heataggregatedgammaglobulin）HS:人血清（Human serum)
I：不加材料的含血清对照试管，冰上保存（Control tubewithserum butno material,keptonice）M加试验材料的含血清试管（Tubecontainingserumplusatestmaterial)）NM：不加材料的含血清试管（Tubecontainingserumbutnomaterial）PVDF：聚偏二氟乙烯（Polyvinylidenefluoride）RBC.红细胞Redbloodcell(s)
5绵羊和兔RBC的制备
5.1去纤维蛋白兔RBC和保存在奥尔塞氏（Alsever's）溶液中的绵羊RBC均在4C条件下储存。绵羊RBC在保存8周后，或第2次洗涤上清中含有肉眼可见血色素（红色）时需丢弃（因为大多数RBC寿命的原因，它们会对补体裂解更敏感，同时自然裂解也增加）。兔RBC比绵羊RBC更易碎，应在保存4周后，或第2次洗涤上清中含有肉眼可见血色素（红色）时去弃。注：所有的离心应在4℃条件下进行。除了另有说明，所有试剂，试管和细胞制剂都需置于碎冰或冰浴中保持冰冷状态。
5.2在4℃条件下，将5mL绵羊或兔RBC在1000g下离心10min。5.3将细胞沉淀悬浮于10mL冷BBS-GEDTA中，37℃孵育10min。离心并使细胞沉淀重新悬浮于10mL4℃的BBS-G-EDTA中。
5.4离心细胞，丢弃上清（洗第1次），细胞沉淀重悬于10mL冰冷的BBS-GM中（钙缓冲液）或BBS-G-EDTA/Mg（镁缓冲液）中（用于吸收血清的细胞用钙缓冲液清洗；用于步骤B检测旁路途径补体消耗的细胞，用镁缓冲液清洗和悬浮）。重复2次（总共洗3次）5.5用分光光度计法对细胞数量进行调节（当浓度为2.0×10°RBC/mL，波长为412nm、光程为1.0cm时，1体积清洗后的压积RBC加人24体积BBS-GM或BBS-G-EGTA/Mg，绵羊RBC吸光度为0.75，免RBC的吸光度为1.30)或用血球计数仪计数。制备10mL4℃下BBS-GM或、BBS-G-EGTA/Mg中浓度为2.0×10°细胞/mL的细胞悬液5.6经过清洗、稀释的RBC冰上放置，至少可使用12h。6血清（补体）的吸收
6.1虽然在血液接触医疗器械材料旁路途径补体激活时，人血清优于豚鼠血清。但有遗传缺陷的人血清却不易获得。用抗体柱吸附法消耗补体成分的人血清不适用于该试验原因有以下两个：a）特异性成分去除不完全，因此还会存在经典途径激活；和b）柱材料可激活旁路途径，降低功能性活性。遗传缺陷C4豚鼠来源的血清［C4(-)GPS]没有经典途径补体活性但完全能胜任旁路途径补体激活。在检测生物材料补体激活作用时，虽然滴度不同（与人血清相比，裂解相同免RBC所需C4（-)GPS）的浓度较大）5，但C4（-）GPS可与人血清具有相近的生物补体激活效果（见表1中琼脂糖凝胶举例）。因此，C4（-）GPS适合作为检测人类全血中旁路途径激活的补体成分以及裂解产物的确定性免疫测定的筛选试验。C4(-)GPS适用于从生物公司购买的补体源，通常标记为试剂级补体6.2可用绵羊RBC和兔RBC吸收血清以清除自发产生的抗绵羊RBC和抗免RBC溶血性抗体。6.2.1将购买的C4（-)GPS储存于一70℃。6.2.2将血清在碎冰上解冻或用冰水（如为冻干剂）复溶。2
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表1镁缓冲液中的兔RBC在人血清中或C4(-)GPS中YY/T0878.2—2015
在37℃条件下与100μL的琼脂糖凝胶2CL-4B接触1h的裂解百分率琼脂糖凝胶\CL-4B
[HS/C4(-)GPS]
12.5/3.13
6.25/1.57
0/0[37℃对照
0/o［冰对照
HS制备液1°
14.2±0.6
23.6±5.2
33.2±2.8
49.9±0.2
51.4±1.6
3个复管的均值土标准偏差。
HS制备液24
11.8±0.8
19.6±2.8
29.4±3.8
45.3±4.6
52.9±0.7
b所示体积为加人到100μL的人体血清或C4(-)GPS的琼脂糖凝胶\CL-4B的体积。人全血清[Quidel(NHSC)]，镁缓冲液1：8稀释。d重组冻干人血清[Sigma(S1764)],镁缓冲液1：4稀释。全豚鼠血清，C4缺陷[Sigma(C1038]，镁缓冲液1：3稀释。C4(-)GPS
21.3±3.3
20.1±0.9
27.3±1.4Www.bzxZ.net
41.3±0.7
58.4±0.5
6.2.3所有的操作都在冰浴中进行，试剂和细胞也需在4℃放置。在4℃条件下，1000g离心，全部操作在冰冷条件下进行是非常关键的，以避免该阶段补体的激活。6.2.4按0.1mL压积RBC/2.5mL血清的比例，将冷血清和4C，钙缓冲液洗涤的以1：1体积混合的绵羊和兔压积RBC通过缓慢摇晃混合，冰上孵育10min，4℃条件下，1000g离心10min。将上清液小心转移至冰上放置的新器血中。6.2.5重复6.2.4的步骤两次。
6.2.6吸收的C4（-)GPS以0.5mL~1.0mL（方便1次试验使用）储存于冰冷的带盖微型离心管中，一70℃保存直至使用。使用当天在碎冰或冰浴中融解，不能重复冻存。7全补体滴定确定最佳血清稀释度7.1一般每种条件采用一支试管或两支试管，如需要对结果进行统计学评价，所有条件宜进行3个平行检测，即每种条件都用3支13mm×100mm圆底一次性使用玻璃试管。各试管预先编号。条件包括\全部裂解”、“无补体（只有RBC，无C\）”、“试验［有或无溶血素的稀释C4（-)GPS]”和“无RBC（血清颜色，补体颜色对照，用最高浓度的血清）”。所有试剂、试管和操作需在4℃条件下进行，试管应放置于冰浴中放置的试管架上。
7.2按7.3～7.4准备两组试管。一组试管内加人镁缓冲液洗涤的绵羊RBC和稀释血清；另一组试管内加人镁缓冲液洗涤的兔RBC和稀释血清。7.3将镁缓冲液洗涤的2.0X10°细胞/mLRBC悬液加入到除“无RBC管以外的所有试管中，每管加入0.05mL由于加人的细胞体积相对于试管很小，宜仔细将准确体积的细胞悬液加人到每个试管的底部中央。“无RBC”管加人0.05mL4℃的镁缓冲液。7.4在4℃条件下，用4℃的镁缓冲液将HS或C4（-)GPS稀释到所需浓度（用最小摇动）。首次试验推荐血清稀释度为1：2～1：20之间。直接将0.05mL稀释的血清加入到每个试验试管的底部。“无补体”管加人0.05mL不含血清的镁缓冲液。“全部裂解”管加人0.05mL蒸馏水代替缓冲液。7.5用手摇动各试管使细胞悬浮，放人试验管架后再置37℃水浴1h，间歇摇动（每隔15min）保持细胞悬浮状态。
7.6水浴1h时，将试管架在冰浴中放置。所有试管加人相同体积4℃的镁缓冲液（如果离心后上清3
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液移到微孔板上读数，只需加人0.4mL/管即可，如果通过分光光度计读数，需加人1.1mL/管）。冷试管需在4℃条件下，1000g离心10min，上清液倒入与之有相应编号的13mm×100mm玻璃试管中或直接放入微孔板内进行读板扫描，注：虽然上清液可以放入微孔板内读数，但旁路途径补体激活试验本身不能在微孔板中进行，因为塑料可能直接激活旁路途径。
7.7在412nm波长处检测上清液的吸光度，对每个试验管和对照管计算裂解百分率。计算方法是通过减去412nm波长处\无RBC”对照管（3个试管的均值），也就是减去较大稀释度管的吸光度值，再除以全部裂解对照管（3个试管的均值）的值，乘以100。A1-A2×100%
式中：
裂解率，%；
A—试验管吸光度；
A2——无RBC对照管吸光度；
A—全部裂解管吸光度
7.8各条件的最终百分裂解用3组重复试验的均值士1SD表示。（1）
7.9对特定批血清的最佳稀释度，即在该稀释度下血清与材料作用后能按步骤B检测出兔RBC裂解。对于绵羊RBC.最佳稀释度定为裂解百分率小于等于5%，而对于兔RBC，裂解百分率则定为40%～80%之间（即裂解是在补体滴度曲线的线性部分）。对于一批吸收后的冻干人血清，典型的最佳稀释度为14[常用来证实C4(-)GPS是人体血清的良好替代品。见表1]，加入的检测体积为0.05mL。对于一批吸收后的人全血清，典型的最佳稀释度为1：8。对于一批吸收后的全C4(-)GPS，典型的最佳稀释度为1：3。
8程序A一材料与C4(-)GPS接触
8.1材料制备
8.1.1使用琼脂糖凝胶CL-4B（cross-linked4%beadedagarose交联后的4%珠状琼脂糖）作为与患者血液接触医疗器械（如抗体消耗antibodydepleting柱）中使用的固体材料的实例。琼脂糖凝胶CL-4B具有直径为40um～165um的湿珠，对球状蛋白质的分离范围（相对分子质量）在60000～20000000之间，对右旋糖酐的分离范围在30000～5000000之间。在2℃～8℃条件下，在含20%乙醇的悬液中储存，不冻结。琼脂糖凝胶\CL-4B是一种补体旁路途径的中等强度的激活剂，可用来作为阳性对照材料。其他可激活旁路途径的材料也可使用（见第10章）。注：琼脂糖凝胶\CL-4B离心时会形成一个分离的沉淀。对于使用临床典型台式离心机离心不足以形成沉淀的材料，与补体一起孵育后，就需要在有适当的控制条件下经过一个过滤步骤。8.1.2一8.2.5中提供的步骤是专门为琼脂糖凝胶CL-4B设计的，当然，其他材料也可用相同的方式检测。其主要目标是以下列方式将已知量的材料与100μL的最小体积血清接触：a）材料与血清接触表面最大；和b）接触后材料与血清易于分离，以便于随后的补体对免RBC的旁路途径激活检测。任一满足这些条件的材料与血清接触方式都是合适的。例如.对于易于与血清分离的材料，用13mm×100mm的圆底直式玻璃试管可能比琼脂糖凝胶\CL-4B所需的斜式玻璃离心管更适宜8.1.2通过用钙缓冲液清洗5次制备检测用琼脂糖凝胶\CL-4B。将一定量的储备的琼脂糖凝胶CL-4B(对于适宜的检测，1.4mL就足够了）加人到冰上放置的塑料离心管中。琼脂糖凝胶CL-4B的加人量事先测定，以得到5次清洗后的体积。用移液管加人10mL4℃的钙缓冲液，加入时用足够的向下喷射力使琼脂糖凝胶CL-4B充分混悬。混悬液在4℃条件下，1Q00g离心10min，将接近沉淀物以上4
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的上清液抽出。再重复操作4次，最后一次清洗后，小心取出沉淀上部所有剩余的液体，加人与沉淀等体积的钙缓冲液（这种情况为800L）。将琼脂糖凝胶CL-4B悬液在碎冰上放置直到使用。8.1.3充分混合1：2稀释的琼脂糖凝胶\CL-4B悬液，将合适体积的液体移入一系列一次性使用15mL玻璃离心管底部，以将所需体积的球粒加入每个试管（如25μL、12.5μL、6.25μL，和3.17μL液珠）。锥形玻璃离心管能在离心后便上部液体全部取出而不破坏琼脂糖凝胶CL-4B沉淀，即使是非常小的体积。所有加材料的试管（M），不加材料（NM)37℃对照试管，和不加材料的冰对照试管（I)都加人1.0mL钙缓冲液，必需确保无少量琼脂糖凝胶\CL-4B粘附于试管壁。所有试管都在4℃条件下，1000g离心10min，小心移走沉淀上部的液体。盖住各试管口，碎冰中4℃放置直到加入血清。8.2材料与未稀释的C4（-)GPS孵育8.2.1将200L吸收的、未稀释、4℃保存的C4（-)GPS加到冰上放置15mL锥形玻璃离心管（M管）底部琼脂糖凝胶\CL-4B沉淀物上，加人NM对照试管中和冰对照试管中。本例中，用200μL而不用最小量的100μL血清是为了保证稀释后有足够的体积用于步骤B中检测。通过倾斜试管为材料与血清提供足够的接触面积（见8.2.3）。如果对其他类型的材料使用了13mm×100mm玻璃试管，可能无法通过倾斜试管的方法增加接触面积（这种情况下，就需要较多的血清来增加与材料的接触面积）。注：检测最少需要3个试管，标记为M（材料），NM（无材料，37℃对照管）和I（冰，最大补体活性对照管）。对于统计学评价，宜至少使用3组试管。另外，除了1和NM外，还可能使用其他对照，包括一个与其他旁路途径补体激活材料进行比较的对照（具有相同的单位面积或其他合适的可测量参数）、一个旁路途径补体激活的阳性试剂对照（如酵母聚糖或菊粉）或一个旁路途径补体激活的阴性试剂对照（如经典途径激活补体的热凝集人丙种球蛋白（HAGG)），或两者都用。如何用酵母聚糖和HAGG作为对照的更多细节讨论见第10章。8.2.2用一只100μL去除尖端以提供较大孔径（以便能快速混合琼脂糖凝胶CL-4B球粒）的移液管，通过四次吸上和排下悬液的方式快速并小心地将各试管内液体混匀。先从I开始，接着是NM，最后是M管，使该混匀操作由低浓度到高浓度依次进行。8.2.3除了1管，其他所有试管立即封口，放人试管架，倾斜10°～15°，放人37℃水中孵育，使得试管尖部没人水中，顶部斜靠在水浴边缘。这样，琼脂糖凝胶CL-4B不会在血清中形成致密沉淀，从而使其与血清有最大的接触面积。将I管于碎冰上放置。8.2.4孵育1h时，将M和NM管放回冰上。立即通过加人4℃的BBS-G-EGTA/MgL镁缓冲液」的方式，将每管内200μLC4(-)GPS稀释到最佳检测浓度（例如，如果用于在1：3稀释度下检测，每管内需加人400L的镁缓冲液）。用不同的巴斯德玻璃吸管将每管内液体吸上和排下，确保血清和缓冲液充分混合。
8.2.5所有试管都在4℃条件下，1000g离心10min。将移液管头插人液体中间高度位置，抽出400L液体移人碎冰上放置的另一标记的玻璃试管中。在1h内检测血清的补体活性（见第9章）。8.3纤维或固体片材
除了需将一定量（以毫克计，正好能被最少0.1mL的血清完全覆盖）的纤维或片材预先室温下放人13mm×100mm玻璃试管中以外，固体纤维或片状材料的全补体激活试验与8.2中琼脂糖凝胶CL-4B的过程相似。随后将0.1mL的4C血清分别加入MNM和I管中。立即将M管和NM管放人37℃水浴，同时将I管碎冰上放置。1h时将M管和NM管从37℃水浴中取出，碎冰上放置。8.4检测规模和试验条件
8.4.1前面所述的一般检测模式可被用于试验不同量的材料得出剂量-反应曲线、相同量的材料在37℃条件下接触不同时间段、或比较不同材料的补体激活。8.4.2推荐检测样本的总量不超过100管最终分析所需的样本数。5
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9程序B—程序A中补体旁路途径激活的血清检测9.1程序B用于检测预先已经与材料接触（程序A)血清可能的旁路途径补体激活。在程序B中，用材料接触血清M与无材料37℃的对照NM相比，镁缓冲液中兔RBC裂解下降来检测程序A（补体组分从血清中清除)中旁路途径补体激活。9.2所有条件宜进行3个平行检测，即每个条件使用3只13mm×100mm一次性使用玻璃试管。试管预先编号。条件包括“全部裂解”、“无补体”“试验”和“无RBC”。所有试剂、试管和操作都在碎冰上或冰水中放置和进行。
9.3免RBC先用镁缓冲液清洗，调节浓度为2X×10°/mL（第5章）加人到所有试管中（0.05mL/管），“无RBC”管除外。“无RBC”管加入0.05mL4℃的镁缓冲液。9.4“无补体（只有RBC)管”加人0.05mL的镁缓冲液。全部裂解管加人0.05mL水。然后，从经材料接触程序（第8章），并为检测免RBC已经稀释到最佳浓度的试验管或对照管（冰上放置）中各取0.05mL血清，分别加人3个相应标记的含免RBC试管中。9.5各试管按7.5~7.9所述进行操作。10
必要的对照
10.1在各程序B检测（第9章）中的对照包括：“全部裂解”、“无补体”（无血清时，缓冲液中RBC的裂解背景）、“无RBC”、和“无材料”（“只有37℃”或NM.在程序A中不加材料）。另外，在有些点宜将绵羊RBC和免RBC同时试验来证实在程序B的镁缓冲液条件中使用的标准血清批未发生非特异性裂解。
10.2程序A（见第8章）中使用除“无材料”以外的对照可以包括：a）一个已知的阳性材料如琼脂糖凝胶\CL-4B（第8章）；b）一个已知的阴性材料（使用无试验材料的玻璃试管即可）；c）一个阳性试剂（如酵母聚糖或菊粉），和；d）一个阴性试剂（如热凝集人丙球蛋白HAGG)[6]。10.3酵母聚糖A（酿酒酵母的细胞壁成分）可用作旁路途径补体激活的标准阳性对照，并在4℃保存。将10mg酵母聚糖加人到1.0mL的钙缓冲液中，再系列稀释成1/10和1/100的稀释液。分别取这3个溶液10μL（分别含100μg、10ug和1μg酵母聚糖）各加入盛有100μL血清的玻璃试管中，以便与试验材料进行比较。其他试管加人不含酵母聚糖的10μL的镁缓冲液。这些量的酵母聚糖宜产生全部，部分和微弱的旁路途径补体活性清除（尽管百分清除率会由血清批次不同而发生变化）。离心会使酵母聚糖形成致密的沉淀，因此程序A后其上部覆盖的血清易于分离。酵母聚糖悬液宜在每个试验前新鲜制备。当程序B中使用最终稀释的血清做检测时，宜对这10uL额外体积用缓冲液加以补偿10.4HAGG的制备：人丙种球蛋白（源自克隆片段Ⅱ、Ⅲ）4℃储存。将10mg人丙种球蛋白加人盛有1.0mL室温BBS的玻璃试管中。轻轻混合并室温放置10min后，宜形成无沉淀的透明液体。再将该制备液置63℃水浴20min。孵育后，将该液体冰上放置，取0.1mL在一70℃条件下保存，得到100μg/10μL的储备液。将10uL解冻后的HAGG加人与实验材料平行设置的血清中作为阴性对照物质（不激活旁路途径，只激活经典途径）。虽然这一剂量的HAGG可通过经典途径消耗补体（可使用YY/T0878.1进行观察），但在C4（-)GPS中不宜发生消耗。11
结果报告和数据分析
11.1因为一些补体蛋白质是温度敏感性的（见表1中举例），放置在37℃的血清对照管（NM管）中免YY/T0878.2—2015
RBC裂解率比放置在冰上的血清对照管（I管）为低。如果程序A后需要进行过滤将材料全部去除，需对第2个冰上放置的无材料血清管（I2）进行相同操作来加以控制，可能会看到I管比管中的补体活性有明显降低。
11.2在程序B中，来自程序A的各管都进行3个平行检测，以检测程序A各管间的显著性差异（≤0.05，使用合适的统计学方法，如方差分析），特别是当各条件之间差异很小时，程序A中每种条件可能至少需要3个平行管。因此，为了获得统计学差异，材料需在程序A进行3个平行试验，程序B中的3个接触管中每个管需再进行3个平行检测。11.3程序B中M管中溶血活性与NM管相比显著降低表示程序A中试验材料通过旁路途径激活补体（消耗补体成分）。
11.4通过适当的统计学试验（如方差分析）计算，p≤0.05时，被认为溶血活性具有显著性差异。结果可以条线图形式呈现各条件的均值和标准差7
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A.1试剂
附录A
（资料性附录）
试剂和缓冲液制备
奥尔塞氏（Alsever）溶液：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.80g，氯化钠（NaCl)0.42g，溶于100mL双蒸水中。
A.2缓冲液
A.2.1按确定的方案制备缓冲液[1工2]。水为蒸馏的无内毒素水。推荐使用巴比妥缓冲液。如果能证明不激活补体，也可使用其他缓冲系统（如TRIS）［4]。除非有其他说明，溶液可在4℃条件下存放一个月。
A.2.25倍BBS（巴比妥缓冲盐）储存液制备：将20.75g氯化钠（NaCI）和2.545g巴比妥盐（5*5-二乙基巴比要酸钠）溶人约400mL水中。用1mol/L盐酸调节pH至7.35，然后在容量瓶中定容至500mL
A.2.3金属溶液制备：制备2.0mol/L氯化镁溶液（40.66gMgCl2·6H.O溶于水，终体积为100mL），和0.3mol/L氯化钙溶液（4.41gCaCl·2HzO溶于水，终体积100mL），并将两种溶液以1：1（体积比)混合。
A.2.4钙缓冲液（BBS-GM工作液）制备：将0.25g凝胶（gelatin）（A型：猪皮，大约300Bloom，如从Sigma购买的[G-1890])溶人50mL水中，缓慢加热和搅拌。在容量瓶中向该凝胶溶液加入50mL5倍BBS储存液中，再加人0.25mL金属溶液，加水至约200mL，用1mol/L盐酸溶液或1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.35，然后定容至250mL。钙缓冲液中含有Mg+和Ca2+，可使补体经典和旁路途径补体发生激活。
A.2.5同样方法制备BBS-G工作液，但是不加金属溶液。A.2.610倍EDTA储存液（o.1mol/LdisodiumdehydrateEDTA）制备：在容量瓶中将7.44gEDTA·2Na·2H,O（磷酸氢二钠EDTA·2H.O）加人约160mL水中，用1mol/L盐酸溶液或1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.65.定容至200mLA.2.70.1mol/LEGTA（4钠盐EGTA·4.5H.O）制备：在容量瓶中将4.683g4钠盐EGTA加人约80mL水中，用1mol/L盐酸溶液或1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.35，定容至100mL。A.2.8BBS-G-EDTA（用于冲洗前制备RBC)制备：在容量瓶中将10mL10倍EDTA储存液加人盛有90mLBBS-G
A.2.9镁缓冲液（BBS-G-EDTA/Mg工作溶液）制备：将0.25g凝胶溶人50mL水中，缓慢加热并搅拌。在容量瓶中将凝胶液加人50mL5倍BBS储存液、0.625mL2.0mol/L氯化镁、4mL0.1molEGTA，加水约至200mL，用1mol/L盐酸溶液或1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.35，定容至250mL。镁缓冲液中EGTA可结合Ca2+。Mg+的存在允许旁路途径激活的发生，而Ca2+的缺失则阻止经典途径的激活。
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