YY/T 1532-2017
基本信息
标准号： YY/T 1532-2017
中文名称：医疗器械生物学评价纳米材料溶血试验
标准类别：医药行业标准(YY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
YY/T 1532-2017.Biological evaluation of medical devices-Nanomaterials-Hemolysis test.
7.5血液样晶的制 备
收集成年健康家兔的新鲜抗凝全血5 mL(采用3.8%柠檬酸三钠溶液1 : 9稀释)于试管中,取其中2 mL~3 mL血液,800 g离心15 min,收集上清液,室温放置。
8血液样本合格判定一 血液样本中PFH和TBH的测定
8.1向 96孔板每孔加入200 μL空白CMH试剂、Cal.QC.加样模板可参见附录B.附录C.
8.2 TBH 样本加样:将20 μL全血与5 mL CMH试剂混合15 min,向96孔板中每孔加入200 μL,共6孔。
8.3PFH样本加样:向每孔加人6.5中制备的100μL血浆,共6孔,再加人100μLCMH试剂。
8.4 将96孔板密封后,置于平板振荡器上轻轻振荡1 min~2 min(中速,可设定为2档~3档,如250次/ min).
8.5于540nm波长处读取各孔吸光度值,然后根据标准曲线回归方程[见式(1)]计算得到PFH和TBH的浓度。PFH样本的最终浓度要乘以稀释因子2;TBH样本的最终浓度要乘以稀释因子251.若PFH浓度低于1 mg/mL,继续下一个试验步骤;若高于1 mg/mL,则当前血液样本不适合检测,需重新采血。
9试验材料与 血液的接触方式
9.1采用 DPBS稀释全血,将8.5中TBH浓度调整至10 mg/mL士1 mg/mL.
9.2纳米材料 :取100 μL试验样品(见6.1)至试管中.每一试验样品制备6管,其中3管用于空白对照。向每管中加入700 μ DPBS.
9.3 复合产品中的纳米材料:取8000 μ试验样品(见6.2)至试管中。每一试验样品制备6管,其中3管用于空白对照。
9.4 对照样品:取100 pL阳性对照(见7.3)和阴性对照(见7.4)至试管中。每-样品制备各2管.向每管中加入700 μL DPBS.
9.5向试验样品组的空白对照3管内加入100μLDPBS,作为“阴性血样”对照,用于评价纳米材料对方法的潜在干扰;其余每管中加人100 μL步骤9.1中制备的稀释全血。
9.6 盖紧试管,轻轻转动混合。每隔30 min观察试验样品在试验过程中是否有絮结、分散、下沉或悬浮.
注:涡旋可能会破坏红细胞,宜尽量避免。.
7.5血液样晶的制 备
收集成年健康家兔的新鲜抗凝全血5 mL(采用3.8%柠檬酸三钠溶液1 : 9稀释)于试管中,取其中2 mL~3 mL血液,800 g离心15 min,收集上清液,室温放置。
8血液样本合格判定一 血液样本中PFH和TBH的测定
8.1向 96孔板每孔加入200 μL空白CMH试剂、Cal.QC.加样模板可参见附录B.附录C.
8.2 TBH 样本加样:将20 μL全血与5 mL CMH试剂混合15 min,向96孔板中每孔加入200 μL,共6孔。
8.3PFH样本加样:向每孔加人6.5中制备的100μL血浆,共6孔,再加人100μLCMH试剂。
8.4 将96孔板密封后,置于平板振荡器上轻轻振荡1 min~2 min(中速,可设定为2档~3档,如250次/ min).
8.5于540nm波长处读取各孔吸光度值,然后根据标准曲线回归方程[见式(1)]计算得到PFH和TBH的浓度。PFH样本的最终浓度要乘以稀释因子2;TBH样本的最终浓度要乘以稀释因子251.若PFH浓度低于1 mg/mL,继续下一个试验步骤;若高于1 mg/mL,则当前血液样本不适合检测,需重新采血。
9试验材料与 血液的接触方式
9.1采用 DPBS稀释全血,将8.5中TBH浓度调整至10 mg/mL士1 mg/mL.
9.2纳米材料 :取100 μL试验样品(见6.1)至试管中.每一试验样品制备6管,其中3管用于空白对照。向每管中加入700 μ DPBS.
9.3 复合产品中的纳米材料:取8000 μ试验样品(见6.2)至试管中。每一试验样品制备6管,其中3管用于空白对照。
9.4 对照样品:取100 pL阳性对照(见7.3)和阴性对照(见7.4)至试管中。每-样品制备各2管.向每管中加入700 μL DPBS.
9.5向试验样品组的空白对照3管内加入100μLDPBS,作为“阴性血样”对照,用于评价纳米材料对方法的潜在干扰;其余每管中加人100 μL步骤9.1中制备的稀释全血。
9.6 盖紧试管,轻轻转动混合。每隔30 min观察试验样品在试验过程中是否有絮结、分散、下沉或悬浮.
注:涡旋可能会破坏红细胞,宜尽量避免。.
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标准内容
ICS_11.040.30
中华人民共和国医药行业标准
YY/T1532—2017
医疗器械生物学评价
纳米材料
溶血试验
Biological evaluation of medical devices-Nanomaterials--Hemolysis test2017-03-28发布
国家食品药品监督管理总局
2018-04-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。YY/T1532—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家食品药品监督管理总局提出。本标准由中国食品药品检定研究院归口。本标准起草单位：中国食品药品检定研究院、国家食品药品监督管理局广州医疗器械质量监督检验中心。
本标准主要起草人：邵安良、徐丽明、杨立峰、柯军，郭欢、杨文润、许建霞。Hii KAoNhi KAca
HiKAoNhiKAca
1范围
医疗器械生物学评价纳米材料
溶血试验
YY/T1532—2017
本标准规定了直接/间接与血液接触的纳米材料及组合在医疗器械中纳米材料的溶血性能试验方法。
本标准适用于直接/间接与血液接触的纳米材料及组合在医疗器械中游离或释放的纳米材料的溶血性能评价。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验（GB/T16886.1一2011,ISO10993-1:2009,IDT)
GB/T16886.4医疗器械生物学评价第4部分：与血液相互作用试验选择（GB/T16886.4一2003,ISO10993-4.2002,IDT)
GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品（GB/T16886.122005.ISO10993-12.2002,IDT
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
GB/T16886.1、GB/T16886.4中界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
methemoglobin
高铁血红蛋白
铁原子已被氧化成高铁离子的血红蛋白。3.1.2
氰化高铁血红蛋白
cyanmethemoglobin
铁原子被氧化成高铁离子，高铁离子已同氰离子相结合的血红蛋白。3.1.3
total blood hemoglobin
总血红蛋白
正常存在于人循环血液中的所有血红蛋白衍生物，包括脱氧血红蛋白、氧合血红蛋白、硫化血红蛋白、碳氧血红蛋白和高铁血红蛋白。3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
Cal：校雅标准品（Calibrationstandard）CMH：氰化高铁血红蛋白（Cyanmethemoglobin）DPBS：不含钙镁的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbercco\sPhosphateBufferedSaline）1
HiKAoNhi KAca
YY/T1532—2017
PEG：聚乙二醇（PolyethyleneGlycol）PFH：血浆游离血红蛋白（PlasmaFreeHemoglobin）QC：质量控制品（QualityControls）TBH：总血红蛋白（TotalBloodHemoglobin）TBHd：稀释到（10士1)mg/mL的血红蛋白浓度[Bloodsampledilutedto(10士1)mg/mL]4总则
4.1本方法描述了直接/间接与血液接触的纳米材料及组合在医疗器械中游离或释放的纳米材料引起的急性体外红细胞破坏（即溶血)的试验方案。本方法的原理是除硫化血红蛋白外，血红蛋白及其衍生物在碱性条件下可被高铁氟化钾氧化成高铁血红蛋白，高铁血红蛋白与氰化钾反应生成CMH，采用微孔板分光光度计（或酶标仪)在540nm波长处读数测定CMH吸光度值。结果用纳米材料与血液接触后释放到血浆中的PFH占TBH的百分比来表示。4.2试验样品可选用纳米材料或组合有纳米材料的复合产品的浸提液。在试验前宜先对样品进行充分的物理、化学表征，以便合理地解释生物学反应。例如颗粒的大小、比表面积和化学特性等会引起不同的试验结果。每次试验应包括阳性对照和阴性对照。试剂、耗材及设备
5.1试剂
血红蛋白氧化剂(CMH试剂）.Cal、DPBS、PEG、TRITONX-100。5.2耗材
96孔板、试管、枪头。
5.3设备
微孔板分光光度计（或酶标仪)、离心机、恒温水浴槽、加样器。6样品制备
6.1纳米材料
将纳米材料样品直接稀释于DPBS中，制备不同浓度的稀释液，至少4个浓度。注1：所选择浓度宜包括溶血率为5%时的浓度。注2：若已知纳米材料的最终应用浓度，宜以9倍该浓度作为供试品。6.2复合产品中的纳米材料
按照GB/T16886.12规定的浸提比例制备供试品。注：必要时宜对供试品中的纳米材料进行表征，如纳米颗粒的浓度、粒径大小等。7Cal,QC、对照及血液样品的制备7.1Cal的制备
以Cal作为贮备液，然后采用CMH试剂作为介质，进行1：2倍稀释得到系列校准标准品，标准曲2
HiiKAoNniKAca
线的吸光度值应包括样品和对照品的吸光度值（示例参见附录A）。7.2QC的制备
YY/T1532—2017
QC的配制参见校准标准品，包括高，中、低3个浓度，这3个浓度应在校准标准品范围内，且与校准标准品的系列浓度不重复（示例参见附录A）。7.3阳性对照的制备
配制10%TRITONX-100水溶液作为阳性对照。注：也可选用1%多案-L-赖氨酸氢漠酸盐水溶液，但宜经验证。7.4阴性对照的制备免费标准下载网bzxz
配制40%PEG（平均分子质量为8000g/mol)贴存原液作为阴性对照，储存在4℃士3℃。7.5血液样品的制备
收集成年健康家免的新鲜抗凝全血5mL（采用3.8%柠檬酸三钠溶液1：9稀释）于试管中，取其中2mL～3mL血液，800g离心15min，收集上清液，室温放置。8血液样本合格判定一血液样本中PFH和TBH的测定8.1向96孔板每孔加人200μL空白CMH试剂Cal,QC。加样模板可参见附录B、附录C。8.2TBH样本加样：将20μL全血与5mLCMH试剂混合15min，向96孔板中每孔加人200μL，共6孔。
8.3PFH样本加样：向每孔加人6.5中制备的100μL血浆，共6孔，再加人100μLCMH试剂。8.4将96孔板密封后，置于平板振荡器上轻轻振荡1min～2min（中速，可设定为2档～3档，如250次/min）
8.5于540nm波长处读取各孔吸光度值，然后根据标准曲线回归方程[见式（1）计算得到PFH和TBH的浓度。PFH样本的最终浓度要乘以稀释因子2；TBH样本的最终浓度要乘以稀释因子251若PFH浓度低于1mg/mL，继续下一个试验步骤；若高于1mg/mL，则当前血液样本不适合检测，需重新采血。
9试验材料与血液的接触方式
9.1采用DPBS稀释全血，将8.5中TBH浓度调整至10mg/mL士1mg/mL。9.2纳米材料：取100μL试验样品（见6.1）至试管中。每一试验样品制备6管，其中3管用于空白对照。向每管中加人700μLDPBS。9.3复合产品中的纳米材料：取800μL试验样品（见6.2）至试管中。每一试验样品制备6管，其中3管用于空白对照。
9.4对照样品：取100μL阳性对照（见7.3）和阴性对照（见7.4）至试管中。每一样品制备各2管。向每管中加人700μLDPBS。
9.5向试验样品组的空白对照3管内加入100μLDPBS，作为阴性血样”对照，用于评价纳米材料对方法的潜在干扰；其余每管中加人100μL步骤9.1中制备的稀释全血。9.6盖紧试管，轻轻转动混合。每隔30min观察试验样品在试验过程中是否有絮结、分散、下沉或悬浮。
注：涡旋可能会破坏红细胞，宜尽量避免。3
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9.7将试管置于37℃土1C水浴箱中孵育3h土15min，每30min转动以混合样品。或者将试管放人带试管转动器的孵箱内37℃士1℃孵育。注：颠倒混合样品使试管底部沉淀的所有红细胞悬浮于溶液中，宜避免剧烈震荡。9.8从水浴箱或孵箱中取出试管。若采用水浴，则用吸水纸拭干试管。9.9将试管800g离心15min，取上清备用。注1：离心结束后，检查试管并记录上清的任何异常现象和（或）颗粒物沉淀。异常现象意味着红细胞或血红蛋白额外破坏或颗粒吸附血红蛋白。有颗粒物沉淀时宜对其进一步表征，了解蛋白质吸附情况，以便讨论对检测结果的影响。
注2：由于某些纳米材料在540nm波长处有吸收，建议将含纳米材料的溶液在540nm波长处进行预试验，若有明显吸收，可采用高速离心法使颗粒形成球状以去除干扰（将上清转移至新试管中，40000r/min离心30min）；若离心法不适宜，赖粒与血液共同孵育后测得的结果通过扣除相同颗粒“阴性血样”对照来进行校正。10溶血的测定
10.1按照7.1和7.2新鲜制备系列Cal和QC。10.2向新96孔板中加人200μL空白CMH试剂Cal,QC及9.1中制备的400μL全血与5mLCMH试剂混合15min后的TBH。加样模板可参照附录C。10.3每孔加人9.9制备的试验样品、阳性和阴性对照各100μL，每一试验样品6孔（共3个平行样），每一试验样品的空白对照6孔（共3个平行样），对照品4孔（阳性和阴性对照各2个平行样，每个2孔）。10.4试验样品组和对照组每孔加人100μLCMH试剂，Cal、QC及TBHd不加CMH试剂。10.5将96孔板密封后，置于平板振荡器上轻轻振荡1min～2min（中速，可设定为2～3档，如250次/min)。
10.6在540nm波长处读取各孔吸光度值，然后根据标准曲线方程[见式（1计算得到所有样品的血红蛋白浓度。
11结果计算
11.1利用吸光度值为纵坐标（Y），Cal浓度（mg/mL）为横坐标（X），绘制标准曲线，获得回归方程，见式(1)：
Y=aX+b
式中：
Y——吸光度值：
a常数；
XCal浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；b常数。
中都海海活香街（1）
11.2根据式（1），由Cal和QC的吸光度值（Y），得到Cal和QC的实际浓度（mg/mL），然后根据式（2）计算理论偏差。
PDFT(%)=
式中：
PDFT—理论偏差；
A—实际浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL)；B
理论浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）。（2)
11.3根据式（1），由试验样品和TBHd的吸光度值Y，得到其血红蛋白浓度（mg/mL）。试验样品及对4
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照品的最终PFH浓度要乘以稀释因子18，TBHd要乘以稀释因子13.5。根据式（3）计算样品的溶血百分率。
PFHample
=×100%
式中：
溶血首分率：
PFHsmple样品PFH浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；TBHd一一稀释到（10士1)mg/mL的血红蛋白浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）。接受准则
·（3）
12.1除最低浓度的Cal外，每一Cal的PDFT应在20%之内，最低浓度Cal的PDFT在30%之内可接受。QC的CV应在20%之内。若3个QC中有2个或每一个QC的至少一个平行孔的PDFT在20%之内，则试验体系可接受，否则需重新试验。12.2每一阳性对照、阴性对照及试验样品的CV应在20%之内。12.3若阳性对照与阴性对照的2个平行样不能满足11.2中的可接受标准，需重复试验。12.4在试验成立的前提下，若试验样品3个平行样中有2个不能满足11.2中的可接受标准，则该试验样品需重新分析。
3结果分析
当试验样品的溶血百分率>5%时，表明试验材料会引起红细胞的破坏。对于纳米材料溶液，需计算试验样品引起溶血百分率为5%时对应的浓度。5
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Cal与QC的制备见表A.1.表A.2。Cal
附录A
（资料性附录）
Cal与QC的制备示例
Cal的制备
QC的制备
制备方法
2mL贮备液
1mLCal,+1mLCMH试剂
1mLCal+1mLCMH试剂
1mLCal,+1mLCMH试剂
1mLCal+1mLCMH试剂
1mLCals+1mLCMH试剂
制备方法
1.5mL忙备原液+0.42mLCMH试剂
200μLQC+800μLCMH试剂
100μLQC+900μLCMH试剂
附录B
（资料性附录）
96孔板加样模板示例1
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TS,(no
blood)
TS,(no
blood)
blood)
blood)
TSe(no
blood)
blood)
TS,(no
blood)
blood)
附录C
(资料性附录）
96孔板加样模板示例2
blood)
blood)
blood)
blood)
Cal。
blood)
blood)
blood)
blood)
blood)
TSa(no
blood)
blood)
blood)
TS,(no
blood)
blood)
TS,(no
blood)
blood)
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中华人民共和国医药行业标准
YY/T1532—2017
医疗器械生物学评价
纳米材料
溶血试验
Biological evaluation of medical devices-Nanomaterials--Hemolysis test2017-03-28发布
国家食品药品监督管理总局
2018-04-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。YY/T1532—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家食品药品监督管理总局提出。本标准由中国食品药品检定研究院归口。本标准起草单位：中国食品药品检定研究院、国家食品药品监督管理局广州医疗器械质量监督检验中心。
本标准主要起草人：邵安良、徐丽明、杨立峰、柯军，郭欢、杨文润、许建霞。Hii KAoNhi KAca
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1范围
医疗器械生物学评价纳米材料
溶血试验
YY/T1532—2017
本标准规定了直接/间接与血液接触的纳米材料及组合在医疗器械中纳米材料的溶血性能试验方法。
本标准适用于直接/间接与血液接触的纳米材料及组合在医疗器械中游离或释放的纳米材料的溶血性能评价。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验（GB/T16886.1一2011,ISO10993-1:2009,IDT)
GB/T16886.4医疗器械生物学评价第4部分：与血液相互作用试验选择（GB/T16886.4一2003,ISO10993-4.2002,IDT)
GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品（GB/T16886.122005.ISO10993-12.2002,IDT
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
GB/T16886.1、GB/T16886.4中界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
methemoglobin
高铁血红蛋白
铁原子已被氧化成高铁离子的血红蛋白。3.1.2
氰化高铁血红蛋白
cyanmethemoglobin
铁原子被氧化成高铁离子，高铁离子已同氰离子相结合的血红蛋白。3.1.3
total blood hemoglobin
总血红蛋白
正常存在于人循环血液中的所有血红蛋白衍生物，包括脱氧血红蛋白、氧合血红蛋白、硫化血红蛋白、碳氧血红蛋白和高铁血红蛋白。3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
Cal：校雅标准品（Calibrationstandard）CMH：氰化高铁血红蛋白（Cyanmethemoglobin）DPBS：不含钙镁的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbercco\sPhosphateBufferedSaline）1
HiKAoNhi KAca
YY/T1532—2017
PEG：聚乙二醇（PolyethyleneGlycol）PFH：血浆游离血红蛋白（PlasmaFreeHemoglobin）QC：质量控制品（QualityControls）TBH：总血红蛋白（TotalBloodHemoglobin）TBHd：稀释到（10士1)mg/mL的血红蛋白浓度[Bloodsampledilutedto(10士1)mg/mL]4总则
4.1本方法描述了直接/间接与血液接触的纳米材料及组合在医疗器械中游离或释放的纳米材料引起的急性体外红细胞破坏（即溶血)的试验方案。本方法的原理是除硫化血红蛋白外，血红蛋白及其衍生物在碱性条件下可被高铁氟化钾氧化成高铁血红蛋白，高铁血红蛋白与氰化钾反应生成CMH，采用微孔板分光光度计（或酶标仪)在540nm波长处读数测定CMH吸光度值。结果用纳米材料与血液接触后释放到血浆中的PFH占TBH的百分比来表示。4.2试验样品可选用纳米材料或组合有纳米材料的复合产品的浸提液。在试验前宜先对样品进行充分的物理、化学表征，以便合理地解释生物学反应。例如颗粒的大小、比表面积和化学特性等会引起不同的试验结果。每次试验应包括阳性对照和阴性对照。试剂、耗材及设备
5.1试剂
血红蛋白氧化剂(CMH试剂）.Cal、DPBS、PEG、TRITONX-100。5.2耗材
96孔板、试管、枪头。
5.3设备
微孔板分光光度计（或酶标仪)、离心机、恒温水浴槽、加样器。6样品制备
6.1纳米材料
将纳米材料样品直接稀释于DPBS中，制备不同浓度的稀释液，至少4个浓度。注1：所选择浓度宜包括溶血率为5%时的浓度。注2：若已知纳米材料的最终应用浓度，宜以9倍该浓度作为供试品。6.2复合产品中的纳米材料
按照GB/T16886.12规定的浸提比例制备供试品。注：必要时宜对供试品中的纳米材料进行表征，如纳米颗粒的浓度、粒径大小等。7Cal,QC、对照及血液样品的制备7.1Cal的制备
以Cal作为贮备液，然后采用CMH试剂作为介质，进行1：2倍稀释得到系列校准标准品，标准曲2
HiiKAoNniKAca
线的吸光度值应包括样品和对照品的吸光度值（示例参见附录A）。7.2QC的制备
YY/T1532—2017
QC的配制参见校准标准品，包括高，中、低3个浓度，这3个浓度应在校准标准品范围内，且与校准标准品的系列浓度不重复（示例参见附录A）。7.3阳性对照的制备
配制10%TRITONX-100水溶液作为阳性对照。注：也可选用1%多案-L-赖氨酸氢漠酸盐水溶液，但宜经验证。7.4阴性对照的制备免费标准下载网bzxz
配制40%PEG（平均分子质量为8000g/mol)贴存原液作为阴性对照，储存在4℃士3℃。7.5血液样品的制备
收集成年健康家免的新鲜抗凝全血5mL（采用3.8%柠檬酸三钠溶液1：9稀释）于试管中，取其中2mL～3mL血液，800g离心15min，收集上清液，室温放置。8血液样本合格判定一血液样本中PFH和TBH的测定8.1向96孔板每孔加人200μL空白CMH试剂Cal,QC。加样模板可参见附录B、附录C。8.2TBH样本加样：将20μL全血与5mLCMH试剂混合15min，向96孔板中每孔加人200μL，共6孔。
8.3PFH样本加样：向每孔加人6.5中制备的100μL血浆，共6孔，再加人100μLCMH试剂。8.4将96孔板密封后，置于平板振荡器上轻轻振荡1min～2min（中速，可设定为2档～3档，如250次/min）
8.5于540nm波长处读取各孔吸光度值，然后根据标准曲线回归方程[见式（1）计算得到PFH和TBH的浓度。PFH样本的最终浓度要乘以稀释因子2；TBH样本的最终浓度要乘以稀释因子251若PFH浓度低于1mg/mL，继续下一个试验步骤；若高于1mg/mL，则当前血液样本不适合检测，需重新采血。
9试验材料与血液的接触方式
9.1采用DPBS稀释全血，将8.5中TBH浓度调整至10mg/mL士1mg/mL。9.2纳米材料：取100μL试验样品（见6.1）至试管中。每一试验样品制备6管，其中3管用于空白对照。向每管中加人700μLDPBS。9.3复合产品中的纳米材料：取800μL试验样品（见6.2）至试管中。每一试验样品制备6管，其中3管用于空白对照。
9.4对照样品：取100μL阳性对照（见7.3）和阴性对照（见7.4）至试管中。每一样品制备各2管。向每管中加人700μLDPBS。
9.5向试验样品组的空白对照3管内加入100μLDPBS，作为阴性血样”对照，用于评价纳米材料对方法的潜在干扰；其余每管中加人100μL步骤9.1中制备的稀释全血。9.6盖紧试管，轻轻转动混合。每隔30min观察试验样品在试验过程中是否有絮结、分散、下沉或悬浮。
注：涡旋可能会破坏红细胞，宜尽量避免。3
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9.7将试管置于37℃土1C水浴箱中孵育3h土15min，每30min转动以混合样品。或者将试管放人带试管转动器的孵箱内37℃士1℃孵育。注：颠倒混合样品使试管底部沉淀的所有红细胞悬浮于溶液中，宜避免剧烈震荡。9.8从水浴箱或孵箱中取出试管。若采用水浴，则用吸水纸拭干试管。9.9将试管800g离心15min，取上清备用。注1：离心结束后，检查试管并记录上清的任何异常现象和（或）颗粒物沉淀。异常现象意味着红细胞或血红蛋白额外破坏或颗粒吸附血红蛋白。有颗粒物沉淀时宜对其进一步表征，了解蛋白质吸附情况，以便讨论对检测结果的影响。
注2：由于某些纳米材料在540nm波长处有吸收，建议将含纳米材料的溶液在540nm波长处进行预试验，若有明显吸收，可采用高速离心法使颗粒形成球状以去除干扰（将上清转移至新试管中，40000r/min离心30min）；若离心法不适宜，赖粒与血液共同孵育后测得的结果通过扣除相同颗粒“阴性血样”对照来进行校正。10溶血的测定
10.1按照7.1和7.2新鲜制备系列Cal和QC。10.2向新96孔板中加人200μL空白CMH试剂Cal,QC及9.1中制备的400μL全血与5mLCMH试剂混合15min后的TBH。加样模板可参照附录C。10.3每孔加人9.9制备的试验样品、阳性和阴性对照各100μL，每一试验样品6孔（共3个平行样），每一试验样品的空白对照6孔（共3个平行样），对照品4孔（阳性和阴性对照各2个平行样，每个2孔）。10.4试验样品组和对照组每孔加人100μLCMH试剂，Cal、QC及TBHd不加CMH试剂。10.5将96孔板密封后，置于平板振荡器上轻轻振荡1min～2min（中速，可设定为2～3档，如250次/min)。
10.6在540nm波长处读取各孔吸光度值，然后根据标准曲线方程[见式（1计算得到所有样品的血红蛋白浓度。
11结果计算
11.1利用吸光度值为纵坐标（Y），Cal浓度（mg/mL）为横坐标（X），绘制标准曲线，获得回归方程，见式(1)：
Y=aX+b
式中：
Y——吸光度值：
a常数；
XCal浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；b常数。
中都海海活香街（1）
11.2根据式（1），由Cal和QC的吸光度值（Y），得到Cal和QC的实际浓度（mg/mL），然后根据式（2）计算理论偏差。
PDFT(%)=
式中：
PDFT—理论偏差；
A—实际浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL)；B
理论浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）。（2)
11.3根据式（1），由试验样品和TBHd的吸光度值Y，得到其血红蛋白浓度（mg/mL）。试验样品及对4
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照品的最终PFH浓度要乘以稀释因子18，TBHd要乘以稀释因子13.5。根据式（3）计算样品的溶血百分率。
PFHample
=×100%
式中：
溶血首分率：
PFHsmple样品PFH浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；TBHd一一稀释到（10士1)mg/mL的血红蛋白浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）。接受准则
·（3）
12.1除最低浓度的Cal外，每一Cal的PDFT应在20%之内，最低浓度Cal的PDFT在30%之内可接受。QC的CV应在20%之内。若3个QC中有2个或每一个QC的至少一个平行孔的PDFT在20%之内，则试验体系可接受，否则需重新试验。12.2每一阳性对照、阴性对照及试验样品的CV应在20%之内。12.3若阳性对照与阴性对照的2个平行样不能满足11.2中的可接受标准，需重复试验。12.4在试验成立的前提下，若试验样品3个平行样中有2个不能满足11.2中的可接受标准，则该试验样品需重新分析。
3结果分析
当试验样品的溶血百分率>5%时，表明试验材料会引起红细胞的破坏。对于纳米材料溶液，需计算试验样品引起溶血百分率为5%时对应的浓度。5
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Cal与QC的制备见表A.1.表A.2。Cal
附录A
（资料性附录）
Cal与QC的制备示例
Cal的制备
QC的制备
制备方法
2mL贮备液
1mLCal,+1mLCMH试剂
1mLCal+1mLCMH试剂
1mLCal,+1mLCMH试剂
1mLCal+1mLCMH试剂
1mLCals+1mLCMH试剂
制备方法
1.5mL忙备原液+0.42mLCMH试剂
200μLQC+800μLCMH试剂
100μLQC+900μLCMH试剂
附录B
（资料性附录）
96孔板加样模板示例1
YY/T1532—2017
YY/T1532—2017
TS,(no
blood)
TS,(no
blood)
blood)
blood)
TSe(no
blood)
blood)
TS,(no
blood)
blood)
附录C
(资料性附录）
96孔板加样模板示例2
blood)
blood)
blood)
blood)
Cal。
blood)
blood)
blood)
blood)
blood)
TSa(no
blood)
blood)
blood)
TS,(no
blood)
blood)
TS,(no
blood)
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