YY/T 1447-2016/ISO 23317:2012.Implants for surgery- In vitro evaluation for apatite-forming ability of implant materials.
6.3.5第4步
设置溶液温度在(36.5士1.5)C.如果溶液总体积不足900 mL,用蒸馏水补足至总体积900 mL。
6.3.6第5步 .
溶液温度在(36.5士1.5)C ,最佳为(36.5土0.5)C。将TRIS缓慢加入到溶液中,同时密切关注pH值变化。在加入少量TRIS后,待其溶解完全且pH值稳定,再加少量TRIS。建议不要--次性加入大量的TRIS,这样会引起pH值的局部剧烈升高而导致磷灰石析出。如果溶液温度没有达到(36.5士0.5)C,建议加入TRIS使其pH值为7.3士0.05,然后停止添加直到溶液温度达到(36.5士0.5)C。当温度为(36.5士0.5)C时,加入TRIS将pH值调至7.45以下。考虑到pH值随着溶液温度升高而降低,因此当温度为(36.5士0.5)"C时,pH值不能超过7.45.
6.3.7第6步
确保溶液温度保持在(36.5士0.5)C。当pH值上升到7.45士0.01时，停止溶解TRIS,使用移液器滴加1 mol/L HCI将pH值调至7.42土0.01,注意确保pH值不要低于7.40。当pH值降低至7.42土0.01时，逐渐加入剩余的TRIS溶液,直到pH值接近7.45.如果还有TRIS剩余,交替加入TRIS和1 mol/L HCI.重复此操作,确保pH值在7.42~7.45范围内,直至TRIS加完。调节溶液的温度至(36.5士0.2)C ,缓慢加入1 mol/L HCI调节将pH值至7.42士0.01 ,并最终在36.5 C且升降温速率小于0.1 C/min时,将pH值调节至7.40。
6.3.8第7 步
将pH计电极从溶液中移出,用蒸馏水冲洗电极，并将冲洗液回收到溶液中。
6.3.9第8 步
将烧杯内调节好pH值的溶液移入1000mL容量瓶，使用蒸馏水多次润洗烧杯,并回收润洗液至容量瓶中。用磁石固定搅拌转子,防止其落到容量瓶内。
6.3.10第9步
添加蒸馏水至标线(此时不必精确定容,因为冷却后体积会变小),容量瓶加盖并用塑料薄膜密封。
6.3.11第10步
播匀后将其放人水中冷却至20 C.

ICS11.040.40
中华人民共和国医药行业标
YY/T1447—2016/IS023317:2012外科植入物
植入材料磷灰石
形成能力的体外评估，
Implants for surgery-In vitro evaluation for apatite-formingabilityofimplantmaterials
（ISO23317:2012,IDT）
2016-01-26发布
国家食品药品监督管理总局
2017-01-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。YY/T1447—2016/ISO23317.2012本标准使用翻译法等同采用ISO23317：2012《外科植人物植人材料磷灰石形成能力的体外评估》。为便于使用，本标准做了下列编辑性修改：按照汉语习惯对一些编排格式进行了修改；一一将一些适用于国际标准的表述改为适用于我国标准的表述；一将第2章“规范性引用文件”中已转化为国标和行标的标准用国标和行标代替。与本标准中规范性引用的国际文件有一致性对应关系的我国文件如下：GB6682—2008分析实验室用水规格和试验方法（ISO3696：1987.MOD）；YY/T0640—2008无源外科植人物通用要求（ISO14630：2005，IDT）。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家食品药品监督管理总局提出。本标准由全国外科植人物和矫形器械标准化技术委员会骨科植人物分技术委员会（SAC/TC110/SC1归口。
本标准起草单位：国家食品药品监督管理局天津医疗器械质量监督检验中心，上海贝奥路生物材料有限公司。
本标准主要起草人·姜熙，景明，卢建熙，卢宵，林开利。1
YY/T1447—2016/IS023317.2012引言
研究表明，各种不同材料通过碟灰石层与活体骨连接。在无细胞和蛋白质而仅有与人体血浆相同离子浓度的模拟体液（SBF)中，材料表面能形成磷灰石层，而该条件下形成的磷灰石与骨矿化物的组成和结构非常相似。
在SBF溶液中评估植人材料上的磷灰石形成能力，对在动物试验前评估材料的体内骨连接能力非常有意义。当生物活性材料植人体内后，在其表面会形成富含Ca和P的薄层。材料从而通过该磷灰石层与活体组织之间形成无明显边界的连接。研究证实，当材料浸泡于SBF中时，在该材料表面同样能形成这种磷灰石层，其组成和结构与骨矿化物非常相似。随着材料的生物活性增加，其表面短期内形成的磷灰石也随之增加。磷灰石层可通过薄膜X射线衍射光谱仪和（或）扫描电子显微镜检测。在SBF中形成的磷灰石也可与下列形式的骨磷灰石相似：缺钙型磷灰石：
低钙/磷原子比的磷灰石；
含有诸如Mg2+，Na+，CI-，HCO，杂质：低结晶度。
注1：由于磷灰石具有生物活性，因此材料表面在体内形成的磷灰石有助于材料与活体骨的连接。在体外通过SBF溶液浸泡，材料表面也能形成与体内相同的磷灰石沉积。例如，Bioglass，CaO-SiO玻璃，NazO-CaO-SiOz玻璃、CeraboneA-W、Ceravital型玻璃陶瓷、羟基磷灰石陶瓷及碱热处理钛金属表面在体内均能形成钙化，这与其在体外SBF中形成的钙化有一定的相关性。但是，在体内材料表面不形成磷灰石并不意味着没有很好骨连接作用。有报道称，一些可吸收材料如β-磷酸三钙CasPO)，和碳酸钙，其表面不形成磷灰石层却也能连接到活体骨上。
注2：有报道称，在不同组成的NazO-CaO-SiOz玻璃植人家免骨缺损后，材料成骨能力与在体外SBF中磷灰石形成能力有着相关性。
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1范围
YY/T1447—2016/ISO23317:2012外科植入物植入材料磷灰石
形成能力的体外评估
本标准规定了在模拟体液(SBF)中材料表面形成的磷灰石的检测方法。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ISO3696：1987分析实验室用水规格和试验方法（Waterforanalyticallaboratoryuse-Specification and test methods)
ISO14630无源外科植人物通用要求（Non-activesurgicalimplants一Generalrequirements）3术语和定义
ISO14630界定的以及下列术语和定义适用于本标准。3.1
apatite
磷酸钙类，包括骨矿化物以及构成骨骼和牙齿的主要无机成分，类似于羟基磷灰石[Caio（PO.)（OH)2]。
注，骨矿化物也含有诸如CO-，F-，Na+和Mg+等离子3.2
apatite-formingability
磷灰石形成能力
材料表面形成碟灰石的能力。
生物活性
bioactivity
在材料界面引发特定生物反应，使得组织和材料形成连接的特性3.4
诱导期
induction period
样品浸人模拟体液后检测材料表面形成磷灰石的时间。3.5
模拟体液simulatedbodyfluid（SBF）与人体血浆组成相似而不含有机成分的无机溶液。3.6
standard glass for evaluating apatite-forming ability评估磷灰石形成能力的标准玻璃在SBF中和植人动物体内显示特定的磷灰石形成能力、具有特定化学组成的标准玻璃。1
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YY/T1447—2016/IS023317:20123.7
thinfilmX-raydiffractionspectrometry(TF-XRD)薄膜X射线衍射光谱法
通过X射线与材料表面形成较小的人射角而获得衍射图谱，检测材料表面薄层中矿物质的方法。4仪器
电子天平，测量精度为土1mg。
配有磁力搅拌的水浴，保持溶液温度在（36.5士2）℃范围，测量温度的精度为0.2℃。4.2
pH计，测量溶液pH值的精度为士0.01。4.3
温度计，测量溶液温度的精度为士0.1℃。4.4
薄膜X射线衍射光谱仪（TF-XRD)，能够检测材料表面薄层中形成的磷灰石。4.5
扫描电子显微镜（SEM)，在达到10000倍的放大倍数下，观测材料平整表面形成的磷灰石颗粒和4.6
（或）磷灰石层。
5检测样品
样品形状和尺寸
本标准适用于取自植人部分和器械的任何形状和尺寸的样品。然而，由于评估材料的生物活性是通过TF-XRD和（或）SEM技术来确认材料表面磷灰石的形成，因此推荐使用圆形或矩形片状样品。推荐的样品尺寸见图1。
单位为毫米
圆形样品
b）矩形样品
图1推荐的样品尺寸
5.2样品制备
5.2.1概述
本标准充许有几种不同的样品制备方法。必要时应通过机加工方式改变植人物原有的形状。2
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基本加工过程
YY/T1447—2016/ISO23317：2012以图1b）所示矩形薄片样品为例。样品应使用粒度120~～400的金刚石砂轮打磨，打磨深度和速度等条件应根据材料情况而定。水溶性材料(如生物活性标准玻璃)应在无水条件下进行加工。凡是能满足磷灰石形成能力检测的常规加工方法均可使用。6模拟体液
SBF应使用表1中规定的组成及浓度。表1SBF和人造血浆的离子浓度
HPO,\-
模拟体液（pH7.40）
浓度（mmol/L）
血浆(pH7.2~7.4)
注1：目前已发现，在表1规定的SBF溶液中的体外磷灰石形成能力与体内成骨性能具有一定相关性。注2：有文献还报道了其他几种SBF配方。6.2
配制SBF的试剂
以下粉末类试剂级化学物质应存放在干燥器中。配制SBF的水应符合ISO3696规定的2级标准。
氯化钠(NaCI)
碳酸氢钠（NaHCO）
氯化钾(KCI)
三水磷酸氢二钾（KHPO.·3H2O）六水氯化镁（MgClz·6HzO）
盐酸溶液c(HCI)=1mol/L
氯化钙(CaCl)或二水氯化钙(CaCl·2HO)硫酸钠（NazSO）
三羟甲基氨基甲烷(TRIS)[(HOCH,),CNH]6.3
SBF的配制
由于SBF对磷灰石过饱和，所以配制方法不当会导致溶液中磷灰石均勾析出。3
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YY/T1447—2016/ISO23317:2012在配制过程中应保持溶液无色、透明，容器表面无析出。一且产生析出，须倒去溶液，洗净容器，重新配制。
表2按溶解顺序列出了配制1LSBF所需的试剂。表2配制1LSBF添加试剂的顺序、试剂量、称量容器、纯度以及相对分子质量顺序
试剂量取决于其纯度。
试剂量”
0mL~5mL
称量容器
称量纸
称量纸
称量瓶
称量瓶
称量瓶
称量瓶
称量瓶
称量纸
表中列出的纯度是绝大多数国家均可获得的典型试剂纯度如果使用二水氯化钙，应注意其相对分子质量与氯化钙不同：质量：0.371g；
纯度：99.0%；
相对分子质量：147.0152。
6.3.2第1步
相对分子质量
在1L的塑料烧杯中加人700mL离子交换蒸馏水和一个搅拌转子，用蒸发血或塑料薄膜覆盖杯口，将其放置在磁力搅拌器上的水浴（4.2)中，同时搅拌加温至（36.5士1.5）℃。附录A给出了配制SBF的装置示意图。
6.3.3第2步
按照表2给出的顺序在（36.5士1.5)℃恒温下溶解试剂，同时应注意以下事项a)
配制SBF溶液避免使用玻璃容器，推荐使用表面光滑且无划痕的塑料容器，因为磷灰石会在玻璃容器表面或塑料容器的划痕上成核。只有当前一种试剂完全溶解之后，才能溶解下一种试剂。由于氯化钙/二水氯化钙通常以小颗粒形式存在，并且对磷灰石析出影响很大。所以氯化钙/c）
二水氯化钙应一颗一颗地缓慢溶解。d)
量简量取1mol/L盐酸溶液前应使用该溶液润洗。称量三水磷酸氢二钾、六水氯化镁、氯化钙/二水氯化钙、氯化钾、硫酸钠等吸湿性试剂应尽量e
快速操作。
6.3.4第3步
在溶解TRIS前，插人pH计电极（4.3），此时溶液的pH应为2.0士1.0。4
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6.3.5第4步
YY/T1447—2016/IS023317.2012设置溶液温度在（36.5士1.5）℃C。如果溶液总体积不足900mL，用蒸馏水补足至总体积900mL。6.3.6第5步
溶液温度在（36.5士1.5）C，最佳为（36.5士0.5）℃。将TRIS缓慢加人到溶液中，同时密切关注pH值变化。在加人少量TRIS后，待其溶解完全且pH值稳定，再加少量TRIS。建议不要一次性加入大量的TRIS，这样会引起pH值的局部剧烈升高而导致磷灰石析出。如果溶液温度没有达到（36.5士0.5）℃，建议加人TRIS使其pH值为7.3士0.05，然后停止添加直到溶液温度达到（36.5士0.5）℃。当温度为（36.5士0.5）C时，加人TRIS将pH值调至7.45以下。考患到pH值随着落液温度开高而降低，因此当温度为（36.5士0.5）C时，PH值不能超过7.45。6.3.7第6步
确保溶液温度保持在（36.5士0.5）℃。当pH值上升到7.45士0.01时，停止溶解TRIS，使用移液器滴加1mol/LHCI将pH值调至7.42士0.01，注意确保pH值不要低于7.40。当pH值降低至7.42士0.01时，逐渐加人剩余的TRIS溶液，直到pH值接近7.45。如果还有TRIS剩余，交替加人TRIS和1mol/LHCl。重复此操作，确保pH值在7.42～7.45范围内，直至TRIS加完。调节溶液的温度至(36.5士0.2)℃，缓慢加人1mol/LHCl调节将pH值至7.42士0.01，并最终在36.5C且升降温速率小于0.1℃/min时，将pH值调节至7.406.3.8第7步
将pH计电极从溶液中移出，用蒸馏水冲洗电极，并将冲洗液回收到溶液中。6.3.9第8步
将烧杯内调节好pH值的溶液移入1000mL容量瓶，使用蒸馏水多次润洗烧杯，并回收润洗液至容量瓶中。用磁石固定搅拌转子，防止其落到容量瓶内。6.3.10第9步
添加蒸馏水至标线（此时不必精确定容，因为冷却后体积会变小），容量瓶加盖并用塑料薄膜密封。6.3.11第10步
摇勾后将其放人水中冷却至20℃。6.3.12第11步
当溶液温度降至20℃时，使用蒸馏水定容。6.4确认SBF的离子浓度
SBF溶液离子浓度应按表1。由于SBF是相对于磷灰石过饱和的亚稳定溶液，因此推荐使用化学分析方法确认SBF溶液的离子浓度。此外，还建议在配置好的SBF溶液中评估标准玻璃表面磷灰石的形成能力。评估磷灰石形成能力的标准玻璃的化学组成参见附录B图B.1。将标准玻璃A、B.C浸人SBF中12h、24h、120h后，通过TF-XRD应检测到磷灰石层形成。5
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YY/T1447—2016/IS023317.20126.5SBF的保存
将配制好的SBF密封保存在塑料瓶中，置于（7.5士2.5）℃C的冰箱内。SBF应在制备后30天内使用。bzxZ.net
推荐将最终的SBF通过过滤方式灭菌，从而消除灰尘颗粒和细菌。因为灰尘能促使磷灰石异相成核，细菌经常吞噬SBF中形成的磷灰石。灭菌应在制备后和（或）评价磷灰石形成能力之前进行。对于制备后（保存前）的灭菌，使用蠕动泵将全部SBF通过一个带有0.22um孔径的无菌通气过滤器过滤，动泵流速为85mL/min～100mL/min。对于在评价磷灰石形成能力之前的灭菌，使用连有0.22μm孔径的无菌通气过滤器的注射器来过滤SBF。使用者可根据具体情况进行选择。7操作步骤
7.1对于致密材料，薄片样品测量尺寸精确到士o.1mm，计算表面积精确到2mm27.2试验所用SBF体积计算公式见式（1)：V,=100mm.s.
式中：
V.—SBF的体积，mm
S。样品的表观面积，mm。
对于多孔材料，SBF用量应大于计算量V.。（1)
7.3取计算用量的SBF加人到塑料瓶或烧杯中，加热到36.5℃，然后按照图2的方法放置样品。整个样品应被浸没在SBF中。
在极少数情况下，磷灰石既会在SBF溶液中均勾析出，也会沉积在样品表面。所以样品放置在SBF溶液中应如图2a)或图2b）所示。如果样品放置呈现图2b)情况，则应检测样品底面形成磷灰石的情况。
圆形样品
b）矩形样品
图2SBF中的样品
7.4样品在36.5℃恒温的SBF溶液浸泡后，按不同时间（不超过4周）取样，并用纯水轻柔冲洗。建议浸泡期为4周。
样品放人干燥器中常温干燥。样品一旦从SBF溶液中取出，就不能再次浸入SBF溶液中。注：骨连接材料表面一般在4周内形成磷灰石。7.5使用TF-XRD(4.5)或（和）SEM(4.6)检测样品表面的磷灰石。TF-XRD测试以CuKα（A=0.15405nm）作为辐射束，29角在3°～50°范围内，扫描速率为2/min，人射束与样品表面形成1°人射角。6
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YY/T1447—2016/ISO23317:2012应对干燥的SEM样品喷金属膜使其具有导电性。分别在高倍（X10000），低倍（×1000）下拍摄SEM照片。
注：TF-XRD可以清晰地辨别样品表面形成的磷灰石。SEM能观察到样品表面的物质形成，而不能辨别表面沉物是否是磷灰石。所以，SEM必须同TF-XRD一起使用。但是，当形成的磷灰石颗粒和薄膜具有可识别的特征时，可以仅使用SEM进行评估。3检测报告
检测报告应包括以下信息：
所有材料的相关数据，包括制造时间、原材料或组成、样品的形状和尺寸：样品制备过程，包括样品表面加工情况；材料孔隙率（可选）；
制样中SBF溶液用量；
SBF浸泡温度（℃）；
检测样品表面磷灰石的方法（TF-XRD或/和SEM）；验证磷灰石存在的TF-XRD衍射图的检测条件和（或)SEM照片的观察条件；g)
通过每个时期磷灰石的存在与否，判断其诱导期（可选）；每个条件的样品数量：
实验室名称和检测日期：
参照本标准。
YY/T1447—2016/ISO23317:2012说明：
表面皿：
聚乙烯烧杯；
磁力转子；
4—水浴；
5磁力搅拌器。
（资料性附录）
配制SBF的装置
图A.1制备SBF的装置示例
附录B
（资料性附录）
YY/T1447—2016/IS023317.2012评估磷灰石形成能力标准玻璃的制备标准玻璃的组成见表B.1。应采用高纯度的二氧化硅、碳酸钠和碳酸钙试剂来制备标准玻璃（图B.1)。
NazO-CaO-SiO2系统中标准玻璃的组成标准玻璃
玻璃A
玻璃B
玻璃C
说明：
玻璃形成：
无玻璃形成；
磷灰石形成：
无磷灰石形成：
溶解。
摩尔组成/%
图B.1NazO-CaO-SiO2系统中标准玻璃和其浸入SBF后形成磷灰石的能力考虑到在高温搬烧后会造成质量损失，应按照表B.2所示量准备试剂。（或者使用预先加热过的试剂以消除质量损失，如碳酸钠，碳酸钙和二氧化硅分别在1000℃加热10h，600℃加热2h，550℃加热1h)
将称量好的试剂放人氧化铝研钵中，混合研磨30min。9
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