YY/T 0127.17-2014.Biological evaluation of medical devices used in dentistry-Part 17: Mouse lymphoma cells (TK) gene mutation test.
c) 将培养后的细胞以200g离心5 min,弃去上清液，加人新鲜培养基配制成5X 10*个/mL~10X10*个/mL的细胞悬液,培养24h后,取少量细胞,测定PE和SMF;
d) 将清除自发突变的细胞扩增后分装于冻存管中冻存。
6.2体外代谢活化 系统
小鼠淋巴瘤基因突变试验应在有和无代谢活化系统的条件下,使细胞与试验物质接触。本部分使用的代谢活化系统为大鼠肝s9加辅助因子(制备方法参见YY/T 0127.10)。
6.3染毒剂量(细胞与受试物 接触)
6.3.1在细胞与受试物接触时，应考虑受试物对细胞毒性的影响。宜根据细胞毒性与预试验的相对存活率进行剂量设计,一般在相对存活率为阴性对照组的20%~80%范围内设高、中、低三个剂量组。组距可选择2~V10之间的一个值,按等比级数分组。低剂量组应无细胞毒性或略有细胞毒性。或者,对于有毒性的材料,最高剂量可选择10% ~20%相对悬浮生长(RSG)的剂量.
6.3.2对于无细胞毒性的受试物,可采用单剂量组试验(即限度试验),受试物的浓度为最大耐受剂量;使用浸提液试验时,为浸提原液。
6.4试验步骤
6.4.1细胞培养
取冻存的细胞,接种于生长培养基内,在37 C ,5% COz饱和湿度的培养箱中作常规悬浮培养,使细胞生长至对数生长期。取对数生长期的L5178Y tk+/- 3.7.2C 小鼠淋巴瘤细胞,调整细胞浓度至10°个/mL.
6.4.2处理(受试物 与细胞接触)
取对数生长期且细胞浓度为10*个/mL的细胞,分别加入含有不同剂量受试物或其浸提液的新鲜集落培养基中,在有或无代谢活化系统条件下,置37 C,5% CO2饱和湿度培养箱继续培养,通常为
3 h~6 h,(可延长到1个或多个细胞周期)。离心,弃上清液,用PBS或无血清培养基洗涤细胞1次,重新悬浮细胞于含20%马血清的RPMI 1640培养基中,并调整细胞密度为2X10*个/mL.细胞与受试物接触3 h~6 h,若试验结果为阴性时,还应在不加S9条件下进行细胞与受试物接触
24 h的试验。
6.4.3 PE。 (0天的平板接种效率)测定取6.4.2中获得的适量细胞悬液，梯度稀释至8个/mL,接种于96孔板(每孔0.2 mL,即平均

ICS11.060.10
中华人民共和国医药行业标准
YY/T0127.17-2014
口腔医疗器械生物学评价
第17部分：
小鼠淋巴瘤细胞（TK）基因突变试验Biological evaluation of medical devices used in dentistry-Part 17:Mouse lymphoma cells (TK) gene mutation test2014-06-17发布
国家食品药品监督管理总局
2015-07-01实施
本部分是《口腔医疗器械生物学评价》系列标准中的一部分标准。YY/T0127.17--2014
《口腔医疗器械生物学评价系列标准》中的YY/T0268《牙科学口腔医疗器械生物学评价第1单元：评价与试验》是口腔医疗器械生物学评价与试验项目的选择，为指南性标准。-YY/T0127是口腔医疗器械具体生物试验方法标准，其中YY/T0127共分为以下部分：一YY/T0127.1口腔材料生物试验方法溶血试验；YY/T0127.2口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法急性全身毒性试验：静脉途径；wwW.bzxz.Net
YY/T0127.3
YY/T0127.4
—YY/T0127.5
YY/T0127.6
-YY/T0127.7
试验；
—YY/T0127.8
口腔医疗器械生物学评价第3部分：根管内应用试验：口腔医疗器械生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法骨埋植试验；口腔医疗器械生物学评价第5部分：吸人毒性试验；口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法显性致死试验；口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法牙髓牙本质应用口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法皮下植人试验；一YY/T0127.9口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法细胞毒性试验：琼脂覆盖法及分子滤过法；
YY/T0127.10口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验（Ames试验）；
一YY/T0127.11牙科学用于口腔的医疗器械生物相容性临床前评价第2单元：口腔材料试验方法盖髓试验；
一YY/T0127.12牙科学口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法微核试验；一YY/T0127.13口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法口腔黏膜刺激试验；-YY/T0127.14口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法急性经口全身毒性试验；一YY/T0127.15口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法亚急性和亚慢性全身毒性试验：经口途径；
一YY/T0127.16口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法哺乳动物细胞体外染色体畸变试验：
YY/T0127.17
口腔医疗器械生物学评价第17部分：小鼠淋巴瘤细胞（TK）基因突变试验。
本部分为YY/T0127的第17部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不应承担识别这些专利的责任。本部分主要参照GB/T16886.3—2008（ISO10993.3：2003）中推荐的OECDGUIDLINEFORTHETESTINGOFCHEMICALS\InVitroMammalianCellGeneMutationTest\476:1997方法制定。
本部分由国家食品药品监督管理总局提出。本部分由全国口腔材料和器械设备标准化技术委员会（SAC/TC99）归口。I
-iiikAoNiikAca
YY/T0127.17-2014
本部分起草单位：四川医疗器械生物材料和制品检验中心（四川大学）、国家食品药品监督管理局北大医疗器械质量监督检验中心、上海生物材料研究测试中心、深圳市医疗器械检测中心。本部分主要起草人：梁洁、袁、张金、孙姣、曹苹、林红、李秋、朱蔚精、陆华、刘尧。-iiiKAoNiKAca
1范围
口腔医疗器械生物学评价
第17部分：
小鼠淋巴瘤细胞（TK)基因突变试验YY/T0127.17—2014
YY/T0127的本部分规定了口腔医疗器械小鼠淋巴瘤细胞（TK）基因突变试验方法，包括操作步骤、数据处理和结果判定。
本部分适用于测定口腔医疗器械的致突变性。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验GB/T16886.3医疗器械生物学评价第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品3术语和定义
GB/T16886.1.GB/T16886.3和GB/T16886.12界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1
突变频率mutantfrequency
观察到的突变细胞数除以存活细胞数。3.2
relative total growth
相对总生长
处理组随时间延长细胞的增长与阴性对照组的细胞增长数之比，计算为相对悬浮生长与相对存活率的乘积。
relativesuspensiongrowth
相对悬浮生长
表达期末处理组与阴性对照组的细胞增长数之比。3.4
活力viability
表达期后平板培养时处理组细胞集落形成效率。3.5
相对存活率relative survival;Rs处理期未平板培养时处理细胞的集落形成效率，通常用处理组与阴性对照组细胞活力的相对数表示。
HiiKAoiKAca
YY/T0127.17—2014
4仪器及试剂
4.1实验室常用设备
倒置相差显微镜，细胞计数器，洁净工作台，CO，恒温培养箱，恒温水浴箱，移液器，低温高速离心机，低温冰箱（低于一80℃）或液氮罐等。4.2培养基、试剂及耗材
4.2.1生长培养基：DMEM、RPMI1640培养基或其他合适的培养基，加10%灭活马血清、100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素。
4.2.2THMG培养基：RPMI1640培养基，加10%马血清、3μg/mL的胸苷、5μg/mL的次黄嘌呤、0.1μg/mL的氨甲蝶呤和7.5μg/mL的甘氨酸。4.2.3THG培养基：不含氨甲蝶呤的THMG培养基。4.2.4集落培养基：RPMI1640培养基，加青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL、加20%灭活马血清。4.2.5阳性对照物：甲基磺酸甲酯（MMS，以含1%DMSO的无血清培养基配制）、环磷酰胺（CPA，以无血清培养基配制)、苯并[a]芪、3-甲基胆葱、三氟胸苷（TFT)。4.2.6pH7.2磷酸盐缓冲液：称取NaCl8.5g、KCI0.2g、NazHPO.12HzO2.85g（或NazHPO42H,0O1.13g）、KH2PO0.27g，溶于1000mL蒸馏水中，用pH计测定并调节至pH7.2。高压灭菌，冷却后冷藏保存。
4.2.7细胞培养血，96孔细胞培养板，离心管等。5样品制备
5.1试样制备
5.1.1按产品说明书制备试样。按GB/T16886.12的原则制备试验液或浸提液。注：固化类材料应考虑固化后放置时间对试验结果的影响。5.1.2溶剂或浸提介质可选用水、生理盐水、无血清培养基等5.1.3适当时，应使用两种适宜的浸提介质，一种是极性溶剂，另一种是非极性溶剂或适合于医疗器械性质和使用的液体，两种溶剂均应与试验系统相容。注：常用的非极性溶剂，如浓度不大于1%的DMSO等。5.2对照
阴性对照：同批号受试物的溶剂或浸提介质。5.2.2阳性对照：无活化系统可选择甲基磺酸甲酯（MMS，以含1%DMSO的无血清培养基配制），甲磺酸乙酯（EMS)、丝裂霉素C(MMC)；有活化系统可选择环磷酰胺（CPA，以无血清培养基配制）、苯并[a]芪，3-甲基胆菌等，
注1：阴性和阳性对照都应与受试物相同的试验条件下制备。注2：必要时还应设置空白对照。6试验方法
6.1细胞系
6.1.1细胞系
本部分使用L5178Ytk+/-3.7.2C小鼠淋巴瘤细胞。2
iiKAoNiKAca
6.1.2细胞自发突变清除
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每次试验前应适时检查细胞的自发突变频率。当细胞突变频率偏高时，按下列步骤对自发突变细胞进行清除：
a）将对数生长的细胞配制成2×105个/mL，加人100倍的THMG液，加人量为总体积的1%。置CO培养箱（含体积分数5%CO2，下同）培养24h；b）培养24h后以200g离心5min，除去上清液，加人新鲜RPMI1640培养液，细胞密度调整为2X105个/mL。加人100倍的THG液，加人量为总体积的1%。培养45h～48h，注意避免过度培养：
c）将培养后的细胞以200g离心5min，弃去上清液，加入新鲜培养基配制成5×10*个/mL～10X10*个/mL的细胞悬液，培养24h后，取少量细胞，测定PE和SMF：d）将清除自发突变的细胞扩增后分装于冻存管中冻存。6.2体外代谢活化系统
小鼠淋巴瘤基因突变试验应在有和无代谢活化系统的条件下，使细胞与试验物质接触。本部分使用的代谢活化系统为大鼠肝S9加辅助因子（制备方法参见YY/T0127.10）。6.3染毒剂量（细胞与受试物接触）6.3.1在细胞与受试物接触时，应考虑受试物对细胞毒性的影响。宜根据细胞毒性与预试验的相对存活率进行剂量设计，一般在相对存活率为阴性对照组的20%～80%范围内设高、中、低三个剂量组。组距可选择2～/10之间的一个值，按等比级数分组。低剂量组应无细胞毒性或略有细胞毒性。或者，对于有毒性的材料，最高剂量可选择10%～20%相对悬浮生长（RSG)的剂量。6.3.2对于无细胞毒性的受试物，可采用单剂量组试验（即限度试验），受试物的浓度为最大耐受剂量：使用浸提液试验时，为浸提原液。6.4试验步骤
6.4.1细胞培养
取冻存的细胞，接种于生长培养基内，在37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中作常规悬浮培养，使细胞生长至对数生长期。取对数生长期的L5178Ytk+/-3.7.2C小鼠淋巴瘤细胞，调整细胞浓度至10个/mL。
6.4.2处理（受试物与细胞接触）取对数生长期且细胞浓度为10°个mL的细胞，分别加人含有不同剂量受试物或其浸提液的新鲜集落培养基中，在有或无代谢活化系统条件下，置37℃，5%CO，饱和湿度培养箱继续培养，通常为3h～6h，（可延长到1个或多个细胞周期）。离心，弃上清液，用PBS或无血清培养基洗涤细胞1次，重新悬浮细胞于含20%马血清的RPMI1640培养基中，并调整细胞密度为2×105个/mL细胞与受试物接触3h～6h，若试验结果为阴性时，还应在不加S9条件下进行细胞与受试物接触24h的试验。
6.4.3PE。（0天的平板接种效率）测定取6.4.2中获得的适量细胞悬液，梯度稀释至8个/mL，接种于96孔板（每孔0.2mL，即平均1.6个/孔），每个剂量做一块96孔板，于37℃，5%CO2饱和湿度下培养12d，计数每块平板中有集落3
HiiKAoNhikAca
YY/T0127.17—2014
生长的孔数，计算Od的平板接种效率(PE。）。6.4.4表达
步骤6.4.2所得的细胞悬液继续培养2d，每天计数细胞密度并保持密度在10°个/mL以下。计算相对悬浮生长（RelativeSuspensionGrowth，RSG)。6.4.5PE,（2d的平板接种效率）测定步骤6.4.4的第2天表达培养结束后，取适量细胞悬液，按步骤6.4.3作梯度稀释并接种于96孔板，培养12d，计数每块平板有集落生长的孔数，计算2d的平板接种效率（PE）。6.4.6TFT抗性突变频率（MF)测定步骤6.4.4的第2天表达培养结束后，取适量细胞悬液，调整细胞密度为1×10*个/mL，加入三氟胸昔，终浓度为3μg/mL。混勾，接种于96孔板（每孔加0.2mL，即平均2000个/孔），每个剂量组作2块平板，37℃，5%COz饱和湿度下培养12d，计数有突变集落生长的孔数。突变集落按大集落（LC：直径≥1/4孔径，密度低）和小集落（SC：直径<1/4孔径，密度高）分别计数，极小集落可再继续培养3d后计数，计算TFT抗性突变频率（MF)。数据处理
7.1平板效率（PE。和PE2）
式中：
平板效率，PE。或PE2！
一无集落生长的孔数；
一总孔数；
-In(EW/TWO
每孔接种细胞数，此式中n取1.6。7.2相对存活率（RS）
式中：
相对存活率，RS。或RS2；
平板效率，PEo、PE或PEz、PE2;剂量组；
阴性对照组。
7.3TFT抗性突变频率（MF)）
-In(EW/TW)/n
应分别计算大集落突变频率（L-MF)，小集落突变频率（S-MF)和总突变频率（T-MF）。式中：
TFT抗性突变频率（通常以10-表示）；-（1）
（2）
·（3）
-iiKAoNiKAca
第二天的平板效率；
无集落生长的孔数；
总孔数；
每孔接种细胞数，此式中n取2000。7.4相对悬浮生长(RSG)
式中：
相对悬浮生长；
处理组表达期末(第2天)细胞增殖倍数：对照组表达期末(第2天)细胞增殖倍数。7.5相对总生长(RTG)
RTG=RSGXRS2X100%
式中：
相对总生长；
相对悬浮生长；
第2天的相对存活率。
7.6小集落突变百分率（SCM)
式中：
8结果判定
小集落突变百分率；
小集落突变频率；
总突变频率。
8.1试验成立的条件
YY/T0127.17—2014
（4）
（5）
阴性对照或溶剂对照在加与不加S9混合物时，短时间处理（3h～6h）：阴性对照和溶剂对照的8.1.1
PE。和PE，应为60%～120%，MF值应在50×10-6～170×10-；悬浮生长（SG）应在8～32；长时间处理（24h）：悬浮生长（SG)应在32～180范围，其余的PE。和PE2，MF值与短时间处理相同。否则，试验数据不可用。
阳性对照的总突变频率（阳性的MF值减去阴性对照的MF值）应≥300×10-。其中，小集落8.1.2
的MF值至少应为40%，即MF值至少应≥120X10-；或阳性对照的MF值与受试物的浓度存在剂量相关关系。
8.1.3满足以上条件，试验结果成立。8.2数据统计分析
选择适当的统计方法，如X2检验，对数据进行统计学分析，显著性水平α=0.05。必要时进行线型趋势分析。
HiiKAoNiKAca
YY/T 0127.172014
8.3结果的判定
8.3.1受试物MF值出现剂量依赖性增高趋势，各剂量组中任意一组剂量的MF值≥阴性对照值MF值加100×10-5（总体评价因子），则判定为阳性。8.3.2当受试物的MF值≥阴性对照的MF值再加100×10-时（相当于阴性对照MF值的2倍），则判定为阳性。
8.3.3各剂量组的MF值若出现剂量依赖性增高趋势，若各剂量组的MF值或高或低，各剂量组的数据相差较大时，应重复试验。
8.3.4仅高剂量组的MF值出现明显增高，则试验结果可疑。8.3.5
5若试验条件成立，试验各剂量组均未见MF值明显增高，即可判定为阴性。8.3.6若任意一剂量组统计学结果有显著性差异，即判断为阳性。若统计学结果无显著性差异，即判断为阴性。
参考文献
YY/T0127.17—2014
GB/T16886.1-2001
医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验[2]
GB/T16886.3—2008
医疗器械生物学评价第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验[3]
GB/T16886.12—2005
5医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品［4]YY/T0127.10—2009
菌回复突变试验（Ames试验）
口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法鼠伤寒沙门氏杆［5］GB15193.20—2003
3TK基因突变试验
［6］卫生部.保健食品安全性毒理学评价规范.2003.[7]］王欣，王雪，张曼，等.小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变试验的结果判定.中国新药杂志.2010，161399-1401
[8J Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals in tended forhuman use (current step 2 version); International Conference on Harmonisation of Technical Require-ments forRegistrationof Pharmaceuticals forHuman Use.2oo8YY/T0127.17-2014
中华人民共和国医药
行业标准
口腔医疗器械生物学评价
第17部分：
小鼠淋巴瘤细胞(TK)基因突变试验YY/T0127.17—2014
中国标准出版社出版发行
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开本880×12301/16
印张0.75字数13千字
2014年9月第一次印刷
2014年9月第一版
书号：155066·2-27336定价18.00元
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