YY/T 0127.18-2016
基本信息
标准号： YY/T 0127.18-2016
中文名称：口腔医疗器械生物学评价 第18部分:牙本质屏障细胞毒性试验
标准类别：医药行业标准(YY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 口腔 医疗器械 生物学 评价 屏障 细胞 毒性 试验
标准分类号
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出版信息
相关单位信息
标准简介
YY/T 0127.18-2016.Biological evaluation of medical devices used in dentistry Part 18 :Dentine barrier cytotoxicity test.
YY/T 0127的本部分规定了口腔材料牙本质屏障细胞毒性试验方法。
YY/T 0127.18适用于评价牙体充填材料和牙齿窝洞治疗的相关材料及其可滤沥成分经牙本质屏障后对细胞毒性的影响。.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注8期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.
GB/T 16886.5医疗 器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验(GB/T16886.5-2003，ISO 10993-5:1999 ,IDT)
GB/T 16886.12医疗器械生物学评价 第12部分:样品制备与参照样品(GB/T 16886.12-2005 , ISO 10993-12; 2002)
ISO 7405-AMD:2013 Dentistry- -Evaluation of biocompatibility of medical devices used in dentistry(牙科学用于 口腔的医疗器械生物相容性评价)
3目的
本试验用于通过细胞培养的方法,评价牙体充填材料的细胞毒性。细胞和材料被- -个牙本质屏障分隔开,从而模拟临床牙齿窝洞用修复材料充填的情况.
如果采用琼脂覆董法或滤膜滤过法所得细胞毒性为0~1级时,则不必进行该试验。
4器具和材料
4.1细胞
使用已建立细胞系的细胞，例如来自ATCC(American Type Culture Collection)[如ATCC CCL1(NCTC clone 929)小鼠成纤维细胞]或者选择克隆SV 40大T抗原基因转染的细胞，例如来源于小牛牙乳头的细胞。细胞应保持在温度为(37士2)C、含5%CO%的潮湿空气的生长培养基中。也可以使用其他拥有类似成牙本质细胞性质的或其他具有与牙髓组织生理相关性质的已经建立细胞系的细胞.
4.2培养基
培养基应适宜所选细胞系,例如由ATCC或类似机构提供。
注:可参见HTTP://WWW.ATCC.ORG的指导。克隆sV 40大T抗原基因转染细胞的生长培养基包含添加20%胎牛血清(FBS)的MEMa.150 IU/mL青霉素.150 pg/mL链霉素.0.125 ug/mL两性霉素B和0.1 mg/mL遗传
YY/T 0127的本部分规定了口腔材料牙本质屏障细胞毒性试验方法。
YY/T 0127.18适用于评价牙体充填材料和牙齿窝洞治疗的相关材料及其可滤沥成分经牙本质屏障后对细胞毒性的影响。.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注8期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.
GB/T 16886.5医疗 器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验(GB/T16886.5-2003，ISO 10993-5:1999 ,IDT)
GB/T 16886.12医疗器械生物学评价 第12部分:样品制备与参照样品(GB/T 16886.12-2005 , ISO 10993-12; 2002)
ISO 7405-AMD:2013 Dentistry- -Evaluation of biocompatibility of medical devices used in dentistry(牙科学用于 口腔的医疗器械生物相容性评价)
3目的
本试验用于通过细胞培养的方法,评价牙体充填材料的细胞毒性。细胞和材料被- -个牙本质屏障分隔开,从而模拟临床牙齿窝洞用修复材料充填的情况.
如果采用琼脂覆董法或滤膜滤过法所得细胞毒性为0~1级时,则不必进行该试验。
4器具和材料
4.1细胞
使用已建立细胞系的细胞，例如来自ATCC(American Type Culture Collection)[如ATCC CCL1(NCTC clone 929)小鼠成纤维细胞]或者选择克隆SV 40大T抗原基因转染的细胞，例如来源于小牛牙乳头的细胞。细胞应保持在温度为(37士2)C、含5%CO%的潮湿空气的生长培养基中。也可以使用其他拥有类似成牙本质细胞性质的或其他具有与牙髓组织生理相关性质的已经建立细胞系的细胞.
4.2培养基
培养基应适宜所选细胞系,例如由ATCC或类似机构提供。
注:可参见HTTP://WWW.ATCC.ORG的指导。克隆sV 40大T抗原基因转染细胞的生长培养基包含添加20%胎牛血清(FBS)的MEMa.150 IU/mL青霉素.150 pg/mL链霉素.0.125 ug/mL两性霉素B和0.1 mg/mL遗传
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标准内容
ICS11.060.10
中华人民共和国医药行业标准
YY/T0127.182016
口腔医疗器械生物学评价
第18部分：牙本质屏障细胞毒性试验Biological evaluation of medical devices used in dentistryPart 18:Dentine barrier cytotoxicity test2016-01-26发布
国家食品药品监督管理总局
2017-01-01实施
YY/T0127《口腔医疗器械生物学评价》分为18个部分：—YY/T0127.1口腔材料生物试验方法溶血试验；YY/T0127.18—2016
-YY/T0127.2
口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法急性全身毒性试验：静脉途径：
—YY/T0127.3
口腔医疗器械生物学评价第3部分：根管内应用试验：一YY/T0127.4口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法骨埋植试验；YY/T0127.5
口腔医疗器械生物学评价第5部分：吸人毒性试验：-YY/T0127.6
-YY/T0127.7
试验：
YY/T0127.8
口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法显性致死试验；口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法牙髓牙本质应用口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法皮下植人试验：-YY/T0127.9
口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法细胞毒性试验：琼脂扩散法及滤膜扩散法：
—YY/T0127.10口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验（Ames试验）；
一YY/T0127.11口腔医疗器械生物学评价第11部分：盖髓试验：—YY/T0127.12牙科学口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法微核试验；YY/T0127.13
口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法口腔黏膜刺激试验；一YY/T0127.14口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法急性经口全身毒性试验；—YY/T0127.15
5口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法亚急性和亚慢性全身毒性试验：经口途径：
YY/T0127.16
6口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法哺乳动物细胞体外染色体畸变试验；
—YY/T0127.17
试验，
口腔医疗器械生物学评价第17部分：小鼠淋巴瘤细胞（TK）基因突变YY/T0127.18口腔医疗器械生物学评价第18部分：牙本质屏障细胞毒性试验。本部分为YY/T0127的第18部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分参考IS07405：2008《牙科学用于口腔的医疗器械生物相容性评价》附录B*牙本质屏障细胞毒性试验”。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家食品药品监督管理总局提出。本部分由全国口腔材料和器械设备标准化技术委员会（SAC/TC99）归口。本部分起草单位：国家食品药品监督管理总局北大医疗器械质量监督检验中心。本部分主要起草人：林红、蒋若丹、郑刚。I
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1范围
口腔医疗器械生物学评价
第18部分：牙本质屏障细胞毒性试验YY/T0127的本部分规定了口腔材料牙本质屏障细胞毒性试验方法。YY/T0127.18-2016
本部分适用于评价牙体充填材料和牙齿窝洞治疗的相关材料及其可滤沥成分经牙本质屏障后对细胞毒性的影响。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T16886.5医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验（GB/T16886.5—2003，ISO10993-5:1999,IDT)
GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品（GB/T16886.12-2005,ISO10993-12:2002)
ISO 7405-AMD.2013 Dentistry-Evaluation of biocompatibility of medical devices used in den-tistry（牙科学用于口腔的医疗器械生物相容性评价）3目的
本试验用于通过细胞培养的方法，评价牙体充填材料的细胞毒性。细胞和材料被一个牙本质屏障分隔开，从而模拟临床牙齿窝洞用修复材料充填的情况。如果采用琼脂覆盖法或滤膜滤过法所得细胞毒性为0～1级时，则不必进行该试验。4器具和材料
4.1细胞
使用已建立细胞系的细胞，例如来自ATCC(AmericanTypeCultureCollection）[如ATCCCCL(NCTCclone929）小鼠成纤维细胞或者选择克隆SV40大T抗原基因转染的细胞，例如来源于小牛牙乳头的细胞。细胞应保持在温度为（37士2）C、含5%CO2的潮湿空气的生长培养基中。也可以使用其他拥有类似成牙本质细胞性质的或其他具有与牙髓组织生理相关性质的已经建立细胞系的细胞。4.2培养基
培养基应适宜所选细胞系，例如由ATCC或类似机构提供。注：可参见HTTP：//WWW.ATCC.ORG的指导。克隆SV40大T抗原基因转染细胞的生长培养基包含添加20%胎牛血清（FBS）的MEMa150IU/mL青需索、150μg/mL链每素、0.125μg/mL两性需素B和0.1mg/mL遗传莓素。
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4.3试剂
4.3.1四唑盐(MTT)[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide]4.3.2抗菌素/抗真菌剂
青毒素、链每素、两性霉素B和遗传霉素（遗传毒素仅适用于克隆SV40转染细胞）。4.4设备和器具
4.4.1培养血
插人式细胞培养血［例如Millicell]。4.4.2培养板
6孔、24孔、48孔和96孔培养板。4.4.3三维细胞培养网
如直径8mm聚酰胺网［例如Sefar或三维网状支架，宽网150μm200μm，纤维直径150μm，厚0.6mm。
4.4.4分隔小室灌注器具
分隔灌注小室（简称灌注小室）可以是3DBioreactor或Minucells（图1）或其他合适的灌注小室。3DBioreactor3灌注小室是一个由聚碳酸酯制成的圆柱形空腔，其内径约6mm，高约20mm。灌注小室被一片牙本质片分隔成上下两个腔（上腔即“窝洞”，下腔即“牙髓腔”），牙本质片被固定在合适的位置（图2）。3DBioreactor\装置的“牙髓腔”部分一侧人口与提供培养基的瓶子相连，另一侧出口与一个转动的泵相连，该泵与回收废培养基的瓶子相连。或者此装置的牙髓腔”部分一侧人口与提供培养基的瓶子和一个转动的泵相连，另一侧出口与回收废培养基的瓶子相连。1）Millicell是Millipore，Billercia，USA产品的商品名。此信息是给本部分用户提供方便，不代表我们认可其产品。用户可以使用其他类似的产品，只要它们可以达到相同的结果。2）
Sefar是Sefar，Wasserburg/Inn，Germany产品的商品名：此信息是给本部分用户提供方便，不代表我们认可其产品，用户可以使用其他类似的产品，只要它们可以达到相同的结果。3DBioreactor是3DBiotek，NewJersey，USA产品的商品名。此信息是给本部分用户提供方便，不代表我们认3)
可其产品。用户可以使用其他类似的产品，只要它们可以达到相同的结果。4)下载标准就来标准下载网
Minucells是德国BadAbbach，Minucells&MinutissueGmbH公司产品的商品名。此信息是给本部分用户提供方便，不代表我们认可其产品。用户可以使用其他类似的产品，只要它们可以达到相同的结果。HKAoNiKAca
说明：
一培养基的供应；
一加热板或合适装置以保证细胞在适宜环境里生长；灌注小室；
一废液瓶。
图1牙本质屏障细胞毒性试验装置示意图说明：
一试验材料；
有细胞的网子；
牙本质片；
不锈钢或合适材料制成的小室壁：不锈钢或合适材料制成的固定牙本质片的支架。图2固定牙本质片的支架和细胞培养灌注小室示意图4.4.5酶标仪
96孔板，波长540nm，或者任何其他适合的光度计。4.4.6牙本质片
来自于人或者牛的牙本质。
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注，如果使用非人源牙本质，使用前应先确定牙本质的通透性，以确保其通透性与人牙牙本质的牙髓-牙本质界面处是同一水平。同一试验所用牙本质片的通透性应尽可能相近。可采用毛细管系统，如Flowdec\测试。测试原理见附录A。通透性测试结果应在同一数量级。5）Flowdec是DeMarcoEngineering，Geneva，Switzerland产品的商品名。此信息是给本部分用户提供方便，不代表我们认可其产品。用户可以使用其他类似的产品，只要它们可以达到相同的结果。3
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5试验步骤
5.1细胞培养准备
使用三维细胞培养并推荐与3DBioreactor或Minucells灌注小室一起使用。根据产品不同，有些聚酰胺网使用前应先用0.1mol/L乙酸浸泡30min，用去离子水清洗3遍，空气干燥。在三维细胞培养网上涂满纤维连接蛋白（o.03mg/mL），在无菌环境下空气干燥。在6孔板的每一个孔内放置一个插人式细胞培养皿（4.4.1），将三维细胞培养网放置在其内，加人1.25mL培养基，再加人20μL细胞密度为4×10°/mL的克隆SV40转染细胞悬液，或加人2mL培养基，再加人40μL细胞密度为2.5×10°的L929细胞悬液。在温度（37土2）℃C，5%CO2，相对湿度（90士10）%的环境下孵育48h后，将三维细胞培养网转移至24孔板继续孵育（14土2）d。一周更换3次培养基，且在第一周结束时将三维细胞培养网转换到一个新的24孔板中。
5.2试样制备
按照生产厂家说明书制备试样，试样直径6mm，厚2mm（试样直径应依据所选小室的尺寸而定）。不固化材料直接使用。材料为液状时，用液状材料浸湿直径6mm的醋酸纤维滤纸。5.3牙本质试片的准备
5.3.1人来源
选择新鲜拔除的无龋磨牙，用手持器械清除牙垢和附着的软组织，在70%乙醇中浸泡至少15min。以与牙长轴垂直的角度，在牙冠最宽处，于咬合面釉质以下，牙髓腔的咬合面边界以上，切取牙本质片。5.3.2牛来源
从3岁～7岁屠宰的牛的中间四颗下切牙中选择完整无过度磨损的切牙。牙齿拔出后，用手持器械清除牙垢和附着的软组织，贮存在0.5%氯胺中或其他相似的试剂中备用。沿牙齿的长轴，尽可能地贴近牙髓腔切取牙本质片。使用靠近牙颈部的牙本质片进行试验。5.3.3牙本质片的处理
用50%的柠檬酸酸蚀牙本质片的“牙髓”面30s，彻底清洗并灭菌，可在0.9%NaCl中高压蒸汽灭菌（121C，9.6MPa，25min），或者在70%乙醇中浸泡15min后再用去离子水彻底清洗。牙本质片可以贮存在（4土2）℃的0.9%NaCI溶液中最多3周。使用之前，对每批牙本质片中的一个样本进行微生物培养以确定牙本质片的无菌性。注：牙本质片的厚度可以根据试验模仿的临床上牙齿窝洞的深度而变化。厚度为（0.5士0.05）mm的牙本质片可以代表中等深度的临床牙齿窝洞下面存留的牙本质的厚度。更薄的牙本质片可以代表临床更深的牙齿窝洞的情况。
牙本质片可以贮存在0.9%NaCI中备用。5.3.4灌注装配
将长满细胞的网子置于实验装置中，放人牙本质片，将其固定在合适的位置。注：合适的固定支架见图2。
用分析介质（含6g/LHEPES缓冲液的生长培养基）以0.3mL/h的速度灌注小室24h。停止灌注，将被试材料放在小室的上腔，直接与牙本质的“窝洞”面接触。4
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一段合适的时间后（如24h或3d），从小室的“牙髓腔”移走长有细胞的网子，将其置于含有0.5mL预热过的1mg/mL的MTT溶液的48孔板中，在（37土2）℃孵育2h。用o.25mLDMSO(Dimethylsulfoxide）提取蓝色的甲瓒沉淀，在室温下震囊荡板子30min。将200μL该溶液转移至一个96孔板内，在540nm波长下测定吸光度值。结果表达为与阴性对照的百分率或吸光度值。一次试验中，每一个材料和对照均使用5～10个小室，每次试验至少重复1次。6对照
每一个受试材料均应使用阳性和阴性对照。阳性对照在接触细胞24h后细胞活性应该低于50%，阴性对照应该对细胞活力没有影响，可参见GB/T16886.12，或采用已知无细胞毒性的物质作为阴性对照。ISO7405-AMD：2013给出了阳性对照材料的例子。疏水的无毒加聚型硅橡胶印模材料是合适的阴性对照。
7结果评价
如果阴性对照与阳性对照的结果没有统计学显著性差异，该试验无效。除了评价描述外，可参见GB/T16886.5获取更多信息。来自3DBioreactor或Minucells装置的试验数据的评价是基于对试验材料的数据和对照材料的数据的统计学比较（非参数方法），每个材料应有5～10个独立的培养试验数据。依据表1评价细胞的损害，依据表2对结果分级。试验报告中应包括评价结果。
表1细胞损害的评价
8试验记录
分级评价
与阴性对照没有统计学差异，但是与阳性对照有差异或吸光度值高于阴性对照与阴性对照和阳性对照均有统计学差异且吸光度值高于阳性对照与阳性对照没有统计学差异，但是与阴性对照有差异或吸光度值低于阳性对照表2受试材料分级
试验记录应该包括以下信息：
a）使用的细胞系；
b）使用的培养基：
c）试验材料的详细信息；
无细胞毒性
中度细胞毒性
重度细胞毒性
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试验材料的详细准备信息；
阳性及阴性对照的详细信息：
与阴性对照相比，细胞活力的百分率；评价结果。
A.1测量装置
测量装置见图A.1。
A.1.1水槽
密封室
不锈钢支架
附录A
（规范性附录）
牙本质片通透性测量
牙本质片
橡胶密封圈
注入气泡
微量管
牙本质片通透性测量装置示意图图A.1
YY/T0127.18—2016
液面距密封室中心为一固定高度，以使牙本质片承受一定的水柱压力（例如32cm水柱压力）。A.1.2密封室
不锈钢制成的密封室内能放置直径约8mm的牙本质片。用内径为6mm的密封圈将牙本质片固定在密封室中间，密封圈内径所限定的面积即为所测牙本质片的通透面积，液体应始终从牙本质片的“牙髓”面向“面”通透。
A.1.3气泡进孔
带有开关，可以允许气泡打人。A.1.4气泡测量器具
计时器，精度0.01s；带刻度的0.1mL微量管，精度5μL，或等效的液体流量计量装置。2测量原理
通过观察和记录在一段时间内液体通过牙本质小管的流量，测量牙本质小管的通透性。A.3通透性测量
A.3.1排除气泡
装配好密封室后，开启水槽，让液体充满整个测量装置，以排除装置内残留的气泡。7
YY/T0127.18—2016
注入气泡
从气泡注人孔打人一个小气泡。A.3.3观察
观察并记录气泡移动的距离和时间，用下式计算牙本质片的通透性：Lp=Q/AT
式中：
L，—牙本质通透性，单位为微升每分钟每平方厘米（μL/min-1·cm-\）；Q
一一观察时间内液体流过牙本质片的体积，单位为微升（μL）：Q一管的截面积×气泡移动的距离；
A牙本质片的通透面积，单位为平方厘米（cm\）；T—观察时间，单位为分钟（min）。8
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中华人民共和国医药行业标准
YY/T0127.182016
口腔医疗器械生物学评价
第18部分：牙本质屏障细胞毒性试验Biological evaluation of medical devices used in dentistryPart 18:Dentine barrier cytotoxicity test2016-01-26发布
国家食品药品监督管理总局
2017-01-01实施
YY/T0127《口腔医疗器械生物学评价》分为18个部分：—YY/T0127.1口腔材料生物试验方法溶血试验；YY/T0127.18—2016
-YY/T0127.2
口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法急性全身毒性试验：静脉途径：
—YY/T0127.3
口腔医疗器械生物学评价第3部分：根管内应用试验：一YY/T0127.4口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法骨埋植试验；YY/T0127.5
口腔医疗器械生物学评价第5部分：吸人毒性试验：-YY/T0127.6
-YY/T0127.7
试验：
YY/T0127.8
口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法显性致死试验；口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法牙髓牙本质应用口腔材料生物学评价第2单元：口腔材料生物试验方法皮下植人试验：-YY/T0127.9
口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法细胞毒性试验：琼脂扩散法及滤膜扩散法：
—YY/T0127.10口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验（Ames试验）；
一YY/T0127.11口腔医疗器械生物学评价第11部分：盖髓试验：—YY/T0127.12牙科学口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法微核试验；YY/T0127.13
口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法口腔黏膜刺激试验；一YY/T0127.14口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法急性经口全身毒性试验；—YY/T0127.15
5口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法亚急性和亚慢性全身毒性试验：经口途径：
YY/T0127.16
6口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法哺乳动物细胞体外染色体畸变试验；
—YY/T0127.17
试验，
口腔医疗器械生物学评价第17部分：小鼠淋巴瘤细胞（TK）基因突变YY/T0127.18口腔医疗器械生物学评价第18部分：牙本质屏障细胞毒性试验。本部分为YY/T0127的第18部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分参考IS07405：2008《牙科学用于口腔的医疗器械生物相容性评价》附录B*牙本质屏障细胞毒性试验”。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家食品药品监督管理总局提出。本部分由全国口腔材料和器械设备标准化技术委员会（SAC/TC99）归口。本部分起草单位：国家食品药品监督管理总局北大医疗器械质量监督检验中心。本部分主要起草人：林红、蒋若丹、郑刚。I
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1范围
口腔医疗器械生物学评价
第18部分：牙本质屏障细胞毒性试验YY/T0127的本部分规定了口腔材料牙本质屏障细胞毒性试验方法。YY/T0127.18-2016
本部分适用于评价牙体充填材料和牙齿窝洞治疗的相关材料及其可滤沥成分经牙本质屏障后对细胞毒性的影响。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T16886.5医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验（GB/T16886.5—2003，ISO10993-5:1999,IDT)
GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品（GB/T16886.12-2005,ISO10993-12:2002)
ISO 7405-AMD.2013 Dentistry-Evaluation of biocompatibility of medical devices used in den-tistry（牙科学用于口腔的医疗器械生物相容性评价）3目的
本试验用于通过细胞培养的方法，评价牙体充填材料的细胞毒性。细胞和材料被一个牙本质屏障分隔开，从而模拟临床牙齿窝洞用修复材料充填的情况。如果采用琼脂覆盖法或滤膜滤过法所得细胞毒性为0～1级时，则不必进行该试验。4器具和材料
4.1细胞
使用已建立细胞系的细胞，例如来自ATCC(AmericanTypeCultureCollection）[如ATCCCCL(NCTCclone929）小鼠成纤维细胞或者选择克隆SV40大T抗原基因转染的细胞，例如来源于小牛牙乳头的细胞。细胞应保持在温度为（37士2）C、含5%CO2的潮湿空气的生长培养基中。也可以使用其他拥有类似成牙本质细胞性质的或其他具有与牙髓组织生理相关性质的已经建立细胞系的细胞。4.2培养基
培养基应适宜所选细胞系，例如由ATCC或类似机构提供。注：可参见HTTP：//WWW.ATCC.ORG的指导。克隆SV40大T抗原基因转染细胞的生长培养基包含添加20%胎牛血清（FBS）的MEMa150IU/mL青需索、150μg/mL链每素、0.125μg/mL两性需素B和0.1mg/mL遗传莓素。
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YY/T0127.182016
4.3试剂
4.3.1四唑盐(MTT)[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide]4.3.2抗菌素/抗真菌剂
青毒素、链每素、两性霉素B和遗传霉素（遗传毒素仅适用于克隆SV40转染细胞）。4.4设备和器具
4.4.1培养血
插人式细胞培养血［例如Millicell]。4.4.2培养板
6孔、24孔、48孔和96孔培养板。4.4.3三维细胞培养网
如直径8mm聚酰胺网［例如Sefar或三维网状支架，宽网150μm200μm，纤维直径150μm，厚0.6mm。
4.4.4分隔小室灌注器具
分隔灌注小室（简称灌注小室）可以是3DBioreactor或Minucells（图1）或其他合适的灌注小室。3DBioreactor3灌注小室是一个由聚碳酸酯制成的圆柱形空腔，其内径约6mm，高约20mm。灌注小室被一片牙本质片分隔成上下两个腔（上腔即“窝洞”，下腔即“牙髓腔”），牙本质片被固定在合适的位置（图2）。3DBioreactor\装置的“牙髓腔”部分一侧人口与提供培养基的瓶子相连，另一侧出口与一个转动的泵相连，该泵与回收废培养基的瓶子相连。或者此装置的牙髓腔”部分一侧人口与提供培养基的瓶子和一个转动的泵相连，另一侧出口与回收废培养基的瓶子相连。1）Millicell是Millipore，Billercia，USA产品的商品名。此信息是给本部分用户提供方便，不代表我们认可其产品。用户可以使用其他类似的产品，只要它们可以达到相同的结果。2）
Sefar是Sefar，Wasserburg/Inn，Germany产品的商品名：此信息是给本部分用户提供方便，不代表我们认可其产品，用户可以使用其他类似的产品，只要它们可以达到相同的结果。3DBioreactor是3DBiotek，NewJersey，USA产品的商品名。此信息是给本部分用户提供方便，不代表我们认3)
可其产品。用户可以使用其他类似的产品，只要它们可以达到相同的结果。4)下载标准就来标准下载网
Minucells是德国BadAbbach，Minucells&MinutissueGmbH公司产品的商品名。此信息是给本部分用户提供方便，不代表我们认可其产品。用户可以使用其他类似的产品，只要它们可以达到相同的结果。HKAoNiKAca
说明：
一培养基的供应；
一加热板或合适装置以保证细胞在适宜环境里生长；灌注小室；
一废液瓶。
图1牙本质屏障细胞毒性试验装置示意图说明：
一试验材料；
有细胞的网子；
牙本质片；
不锈钢或合适材料制成的小室壁：不锈钢或合适材料制成的固定牙本质片的支架。图2固定牙本质片的支架和细胞培养灌注小室示意图4.4.5酶标仪
96孔板，波长540nm，或者任何其他适合的光度计。4.4.6牙本质片
来自于人或者牛的牙本质。
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注，如果使用非人源牙本质，使用前应先确定牙本质的通透性，以确保其通透性与人牙牙本质的牙髓-牙本质界面处是同一水平。同一试验所用牙本质片的通透性应尽可能相近。可采用毛细管系统，如Flowdec\测试。测试原理见附录A。通透性测试结果应在同一数量级。5）Flowdec是DeMarcoEngineering，Geneva，Switzerland产品的商品名。此信息是给本部分用户提供方便，不代表我们认可其产品。用户可以使用其他类似的产品，只要它们可以达到相同的结果。3
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5试验步骤
5.1细胞培养准备
使用三维细胞培养并推荐与3DBioreactor或Minucells灌注小室一起使用。根据产品不同，有些聚酰胺网使用前应先用0.1mol/L乙酸浸泡30min，用去离子水清洗3遍，空气干燥。在三维细胞培养网上涂满纤维连接蛋白（o.03mg/mL），在无菌环境下空气干燥。在6孔板的每一个孔内放置一个插人式细胞培养皿（4.4.1），将三维细胞培养网放置在其内，加人1.25mL培养基，再加人20μL细胞密度为4×10°/mL的克隆SV40转染细胞悬液，或加人2mL培养基，再加人40μL细胞密度为2.5×10°的L929细胞悬液。在温度（37土2）℃C，5%CO2，相对湿度（90士10）%的环境下孵育48h后，将三维细胞培养网转移至24孔板继续孵育（14土2）d。一周更换3次培养基，且在第一周结束时将三维细胞培养网转换到一个新的24孔板中。
5.2试样制备
按照生产厂家说明书制备试样，试样直径6mm，厚2mm（试样直径应依据所选小室的尺寸而定）。不固化材料直接使用。材料为液状时，用液状材料浸湿直径6mm的醋酸纤维滤纸。5.3牙本质试片的准备
5.3.1人来源
选择新鲜拔除的无龋磨牙，用手持器械清除牙垢和附着的软组织，在70%乙醇中浸泡至少15min。以与牙长轴垂直的角度，在牙冠最宽处，于咬合面釉质以下，牙髓腔的咬合面边界以上，切取牙本质片。5.3.2牛来源
从3岁～7岁屠宰的牛的中间四颗下切牙中选择完整无过度磨损的切牙。牙齿拔出后，用手持器械清除牙垢和附着的软组织，贮存在0.5%氯胺中或其他相似的试剂中备用。沿牙齿的长轴，尽可能地贴近牙髓腔切取牙本质片。使用靠近牙颈部的牙本质片进行试验。5.3.3牙本质片的处理
用50%的柠檬酸酸蚀牙本质片的“牙髓”面30s，彻底清洗并灭菌，可在0.9%NaCl中高压蒸汽灭菌（121C，9.6MPa，25min），或者在70%乙醇中浸泡15min后再用去离子水彻底清洗。牙本质片可以贮存在（4土2）℃的0.9%NaCI溶液中最多3周。使用之前，对每批牙本质片中的一个样本进行微生物培养以确定牙本质片的无菌性。注：牙本质片的厚度可以根据试验模仿的临床上牙齿窝洞的深度而变化。厚度为（0.5士0.05）mm的牙本质片可以代表中等深度的临床牙齿窝洞下面存留的牙本质的厚度。更薄的牙本质片可以代表临床更深的牙齿窝洞的情况。
牙本质片可以贮存在0.9%NaCI中备用。5.3.4灌注装配
将长满细胞的网子置于实验装置中，放人牙本质片，将其固定在合适的位置。注：合适的固定支架见图2。
用分析介质（含6g/LHEPES缓冲液的生长培养基）以0.3mL/h的速度灌注小室24h。停止灌注，将被试材料放在小室的上腔，直接与牙本质的“窝洞”面接触。4
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一段合适的时间后（如24h或3d），从小室的“牙髓腔”移走长有细胞的网子，将其置于含有0.5mL预热过的1mg/mL的MTT溶液的48孔板中，在（37土2）℃孵育2h。用o.25mLDMSO(Dimethylsulfoxide）提取蓝色的甲瓒沉淀，在室温下震囊荡板子30min。将200μL该溶液转移至一个96孔板内，在540nm波长下测定吸光度值。结果表达为与阴性对照的百分率或吸光度值。一次试验中，每一个材料和对照均使用5～10个小室，每次试验至少重复1次。6对照
每一个受试材料均应使用阳性和阴性对照。阳性对照在接触细胞24h后细胞活性应该低于50%，阴性对照应该对细胞活力没有影响，可参见GB/T16886.12，或采用已知无细胞毒性的物质作为阴性对照。ISO7405-AMD：2013给出了阳性对照材料的例子。疏水的无毒加聚型硅橡胶印模材料是合适的阴性对照。
7结果评价
如果阴性对照与阳性对照的结果没有统计学显著性差异，该试验无效。除了评价描述外，可参见GB/T16886.5获取更多信息。来自3DBioreactor或Minucells装置的试验数据的评价是基于对试验材料的数据和对照材料的数据的统计学比较（非参数方法），每个材料应有5～10个独立的培养试验数据。依据表1评价细胞的损害，依据表2对结果分级。试验报告中应包括评价结果。
表1细胞损害的评价
8试验记录
分级评价
与阴性对照没有统计学差异，但是与阳性对照有差异或吸光度值高于阴性对照与阴性对照和阳性对照均有统计学差异且吸光度值高于阳性对照与阳性对照没有统计学差异，但是与阴性对照有差异或吸光度值低于阳性对照表2受试材料分级
试验记录应该包括以下信息：
a）使用的细胞系；
b）使用的培养基：
c）试验材料的详细信息；
无细胞毒性
中度细胞毒性
重度细胞毒性
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试验材料的详细准备信息；
阳性及阴性对照的详细信息：
与阴性对照相比，细胞活力的百分率；评价结果。
A.1测量装置
测量装置见图A.1。
A.1.1水槽
密封室
不锈钢支架
附录A
（规范性附录）
牙本质片通透性测量
牙本质片
橡胶密封圈
注入气泡
微量管
牙本质片通透性测量装置示意图图A.1
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液面距密封室中心为一固定高度，以使牙本质片承受一定的水柱压力（例如32cm水柱压力）。A.1.2密封室
不锈钢制成的密封室内能放置直径约8mm的牙本质片。用内径为6mm的密封圈将牙本质片固定在密封室中间，密封圈内径所限定的面积即为所测牙本质片的通透面积，液体应始终从牙本质片的“牙髓”面向“面”通透。
A.1.3气泡进孔
带有开关，可以允许气泡打人。A.1.4气泡测量器具
计时器，精度0.01s；带刻度的0.1mL微量管，精度5μL，或等效的液体流量计量装置。2测量原理
通过观察和记录在一段时间内液体通过牙本质小管的流量，测量牙本质小管的通透性。A.3通透性测量
A.3.1排除气泡
装配好密封室后，开启水槽，让液体充满整个测量装置，以排除装置内残留的气泡。7
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注入气泡
从气泡注人孔打人一个小气泡。A.3.3观察
观察并记录气泡移动的距离和时间，用下式计算牙本质片的通透性：Lp=Q/AT
式中：
L，—牙本质通透性，单位为微升每分钟每平方厘米（μL/min-1·cm-\）；Q
一一观察时间内液体流过牙本质片的体积，单位为微升（μL）：Q一管的截面积×气泡移动的距离；
A牙本质片的通透面积，单位为平方厘米（cm\）；T—观察时间，单位为分钟（min）。8
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