YY/T 0879.1-2013
基本信息
标准号： YY/T 0879.1-2013
中文名称：医疗器械致敏反应试验 第1部分:小鼠局部淋巴结试验(LLNA)放射性同位素掺入法
标准类别：医药行业标准(YY)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 医疗器械 致敏 反应 试验 小鼠 局部 淋巴结 放射性 同位素 掺入
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
YY/T 0879.1-2013.Test for sensitization of medical devices-Part 1:Murine local lymph node assay (LLNA) : Radioisotope incorporation method.
5试验样品的制备
5.1宜根据 GB/T 16886.12推荐的原则制备试验样品。所有固体材料应进行浸提。应使用极性溶剂(水性)和非极性(非水性或有机)溶剂，如DMSO或A0O等进行浸提。
5.2非 刺激性液体试验样品和凝胶应直接使用。刺激性液体应根据液体试验样品的溶解度,使 用极性或非极性溶剂进行稀释,直到溶液没有刺激性。
5.3 全水溶液不适用于耳部。因此宜在每10 mL极性对照和试验溶液中加入0.05 g羟乙基纤维索以辅助溶液在耳部存留。
5.4
用于浸提的试验样品宜与器械最终使用的表面相- -致。
5.5
样品应按照终产品灭菌的方法进行灭菌。
5.6
宜注意制样过程中不要污染样品,推荐使用无菌技术操作。
注:LlNA检验化学物-般采用剂量效应方式。医疗器械供试样晶可能为浸提液,这种情况下仅有单剂最用于试验，一般可检验未稀释的浸提液。不过，当浸提液含有高毒性成分时,毒性在LLNA中可导致阴性反应。因此在LLNA中检验高毒性没提液(见GB/T 1686.5时,推荐采用剂量效应方式和稀释浸提液。
6阳性对照的制备
6.1非极性 阳性对照-
称取0.025 g的DNCB并放人烧瓶中。加入足量的DMSO完全溶解DNCB,加入DMSO补足10mL。盖住并摇晃烧瓶直到获得均匀的溶液。阳性对照的剂量以临床观察中不产生全身毒性为宜。
6.2极性阳性对照一中性福尔马林可购买市售商品。(或用PBS稀释甲醛，甲醛体积为总体积的1/10。稀释方法:在10mL的烧瓶中放入1mL的甲醛。加入足量的PBS混合这两种溶液，另加PBS补足10 mL,盖住并摇见烧瓶直到获得均匀的溶液。)
6.3极性溶液不适用于耳部。 因此,本试验中,在每10 mL极性阳性对照溶液中加入0.05 g羟乙基纤维素以辅助溶液在耳部存留直到吸收。
6.4对所有需要浸提的样品,按照GB/T16886.12制备极性和非极性浸提液(推荐使用DMSO或A0O,但也可使用ICCVAM文件所列出的其他浸提介质)。
注:在经常进行LLNA时,在6个月或更长时间内的阳性反应具有良好的一致性,宜至少每6个月进行- -次阳性物.
对照实验。
7动物处理
7.1动物选择与饲养
宜使用7~12周龄、健康、未孕的雌性CBA/Ca或CBA/j小鼠。体重差异应低于平均体重的20%。
5试验样品的制备
5.1宜根据 GB/T 16886.12推荐的原则制备试验样品。所有固体材料应进行浸提。应使用极性溶剂(水性)和非极性(非水性或有机)溶剂，如DMSO或A0O等进行浸提。
5.2非 刺激性液体试验样品和凝胶应直接使用。刺激性液体应根据液体试验样品的溶解度,使 用极性或非极性溶剂进行稀释,直到溶液没有刺激性。
5.3 全水溶液不适用于耳部。因此宜在每10 mL极性对照和试验溶液中加入0.05 g羟乙基纤维索以辅助溶液在耳部存留。
5.4
用于浸提的试验样品宜与器械最终使用的表面相- -致。
5.5
样品应按照终产品灭菌的方法进行灭菌。
5.6
宜注意制样过程中不要污染样品,推荐使用无菌技术操作。
注:LlNA检验化学物-般采用剂量效应方式。医疗器械供试样晶可能为浸提液,这种情况下仅有单剂最用于试验，一般可检验未稀释的浸提液。不过，当浸提液含有高毒性成分时,毒性在LLNA中可导致阴性反应。因此在LLNA中检验高毒性没提液(见GB/T 1686.5时,推荐采用剂量效应方式和稀释浸提液。
6阳性对照的制备
6.1非极性 阳性对照-
称取0.025 g的DNCB并放人烧瓶中。加入足量的DMSO完全溶解DNCB,加入DMSO补足10mL。盖住并摇晃烧瓶直到获得均匀的溶液。阳性对照的剂量以临床观察中不产生全身毒性为宜。
6.2极性阳性对照一中性福尔马林可购买市售商品。(或用PBS稀释甲醛，甲醛体积为总体积的1/10。稀释方法:在10mL的烧瓶中放入1mL的甲醛。加入足量的PBS混合这两种溶液，另加PBS补足10 mL,盖住并摇见烧瓶直到获得均匀的溶液。)
6.3极性溶液不适用于耳部。 因此,本试验中,在每10 mL极性阳性对照溶液中加入0.05 g羟乙基纤维素以辅助溶液在耳部存留直到吸收。
6.4对所有需要浸提的样品,按照GB/T16886.12制备极性和非极性浸提液(推荐使用DMSO或A0O,但也可使用ICCVAM文件所列出的其他浸提介质)。
注:在经常进行LLNA时,在6个月或更长时间内的阳性反应具有良好的一致性,宜至少每6个月进行- -次阳性物.
对照实验。
7动物处理
7.1动物选择与饲养
宜使用7~12周龄、健康、未孕的雌性CBA/Ca或CBA/j小鼠。体重差异应低于平均体重的20%。
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标准内容
ICS 11.040.01
中华人民共和国医药行业标准
YY/T 0879.1-2013
医疗器械致敏反应试验
第1部分：小鼠局部淋巴结试验（LLNA）放射性同位素掺入法
Test for sensitization of medical devices-Part 1:Murine local lymph node assay (LLNA) : Radioisotopeincorporation method
2013-10-21发布
国家食品药品监督管理总局
2014-10-01实施
YY/T0879的总标题是《医疗器械致敏反应试验》，包括以下部分：第1部分：小鼠局部淋巴结试验（LLNA)放射性同位素掺人法有关其他方面的致敏反应试验将有其他部分的标准。本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草。YY/T0879.1—2013
YY/T0879的本部分参考ASTMF2148-2007《使用小鼠局部淋巴结试验（LLNA）评价发型接触性超敏反应的标准规范》制定。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家食品药品监督管理总局提出。本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会（SAC/TC248)归口。本部分主要起草单位：国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心。本部分参加起草单位：国家食品药品监督管理局北大医疗器械质量监督检验中心、上海生物材料研究测试中心。
本部分主要起草人：孙立魁、侯丽、刘成虎、韩建民、孙皎、陆华。YY/T 0879.1—2013
医疗器械的材料组分、加工助剂或消洗及灭菌残留物都可能诱发机体发生超敏反应。GB/T16886.10中推荐了三种测定医疗器械潜在皮肤致敏性的动物试验，包括豚鼠最大剂量试验（GPMT）、封闭式贴敷试验（Buchler试验）和小鼠局部淋巴结试验（LLNA）。GB/T16886.10未给出LI.NA方法步骤。
目前国际间已按受LLNA为豚鼠试验的唯一替代试验用于检验单一化学物，为化学物的首选测定法。与豚鼠致敏试验相比，LLNA具有以下优点：a）试验周期短。LLNA总周期为7天，而豚鼠致敏试验则需要24犬。b）所需试验动物较小。相比之下，LLNA更符合GB/T16886.2中动物福利要求。LLNA能得到刺激的定量反应数据，而非主观评价，可用丁剂量效应的测定，并提供可进行统计学分析的客观数据。
与豚鼠致敏反应相似，LLNA也是首选用于单一化学物致敏潜能的检测。LLNA检测了初期（诱导）的致敏过程，而豚鼠致敏试验则检测了后期（激发）的致敏过程。对不能渗透皮肤的某些金属和高分子量试验样品出现假阴性，假阳性的情况，可能需要豚鼠试验来评价其潜在的致敏性。YY/T0879的本部分中需要使用放射性同位素。因此，鼓励寻找放射性同位素的若代品，当新方法得到确认后，YY/T0879的本部分即可采用。
1范围
医疗器械致敏反应试验
第1部分：小鼠局部淋巴结试验（LLNA）放射性同位素掺入法
YY/T0879的本部分给出了医疗器械/材料致敏试验的检测方法YY/T0879.1——2013
本部分预期为豚鼠致敏试验提供一个替代性方法，无其适用于只接触完好皮肤的医疗器械/材料。然而，当评定金属材料或用于深部组织或损伤表面医疗器械产品/材料的致敏反应时，仍然推荐使用豚鼠致敏试验。
本部分只适用于能人皮肤的低分子量化学物，该吸收的化学物或代谢物可结合于大分子物质，如蛋白质以形成免疫原性复合物
2规范性引用文件此内容来自标准下载网
下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注自期的引用文件，仅注口期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用支件，其最新版本（包括所有的修改单）适用子GB/T16886.1
医疗器械生物学评价
GB/T16886.2医疗器械生物学评价文件。
第1部分，风险管理过稳中的评价与证验第2部分·动物福利要求
医疗器械生物学评价第10部分：期激与迟发型超敏反应试验GB/T1688610
GB/T16886.71
GB/T16886.12
3术语和定义
医疗器械生协学评价第1部分全身毒性试验医疗器械生物学评价第12部分，样品制备与参服样品GB/T16886.1、GB/T16886.2和（GB/T16886.10界定的术语和定义适用于本文件。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。，
A0O：丙酮橄榄油溶液（4：1体积比）DMSO二甲基亚矾
DNCB:2，4二硝基氯苯
ICCVAM：机构间替代方法评价协调委员会PBS:磷酸盐缓冲液(pH7.2)
TCA：5%三氟乙酸
H-TdR：\H-胸腺嘧啶核苷，7.4×10Bq/mm（2Ci/mM)(PBS)；1125IUI)R-112放射性尿嘧啶核苷
YY/T 0879.1—2013
5试验样品的制备
5.1宜根据GB/T16886.12推荐的原则制备试验样品。所有固体材料应进行浸提。应使用极性溶剂(水性）和非极性（非水性或有机)溶剂，如DMSO或AOO等进行浸提。5.2非刺激性液体试验样品和凝胶应直接使用。刺激性液体应根据液休试验样品的溶解度，使用极性或非极性溶剂进行稀释，直到溶液没有刺激性，5.3全水溶液不适用于耳部。因此，宜在每10mL极性对照和试验溶波中加人0.05g羟乙基纤维素以辅助溶波在耳部存留。
5.4用于浸提的试验样品它与器械最终使用的表面相一致。5.5样品应按照终产品灭菌的方法进行灭菌。5.6宜注意制样过程中不要污染样品，推荐使用无菌技术操作。注：LI.NA检验化学物一般采用剂量效应方式。医疗器械供试样品可能为浸提液，这种情况下仅有单剂量用于试验，一般可检验未稀释的浸提液。不过，当浸提液含有高毒性成分时，毒性在ILNA中可导致阴性反应。因此在LLNA中检验高毒性没提液（见GB/T16886.5)时，推荐采用剂量效应方式和释浸提液。6阳性对照的制备
6.1非极性阳性对照一称取0.025g的DNCB并放人烧瓶中。加人足量的DMSO完全溶解LNCB，加入DMSO补足10mL。盖住并摇见烧瓶直到获得均匀的溶液。阳性对照的剂量以临床观察中不产生全身毒性为宜。
6.2极性阳性对照一中性福尔马林可购买市售商品。（或用PBS稀释甲醛，甲醛体积为总体积的1/10。稀释方法：在10mL的烧瓶中改人1mL的甲醛。加人足量的PBS混合这两种溶液，另加PBS补足10m，盖任并摇见烧瓶直到获得内匀的溶液。）6.3极性溶液不适用丁耳部。因此，本试验中，在每10ml.极性阳性对照溶液中加人0.05g羟乙基纤维素以辅助溶液在耳部存留到吸收。6.4对所有需要浸提的样品，按照GB/T16886.12制备极性和非极性浸提渡（推荐使用DMSO或AOO，但也可使用ICCVAM文件所列出的其他浸提介质）。注：在经常进行LLNA时，在6个月或更长时间内的阳性反应具有良好的一致性，宜牟少每6个月进行一次阳性物对照实验。
7动物处理
7.1动物选择与饲养
宜使用7~12周龄、健康、术孕的雌性CBA/Ca或CBA/i小鼠，体重差异应低于平均休重的20%。其他适宜的实验动物品系如BALB/也可使用，但宜进行论证。根据处理分组，每笼5只饲养。所有的动物试验应在经国家认可机构批准并符合实验室动物福利全部适用法规的实验室内进行，并且还应符合GB/T16886.2的要求。
7.2试验前动物准备
第1天，检查并标记每组动物（不能使用耳部标记法）。精确称量每只小鼠的体重。7.3供试液处理动物
7.3.1阳性对照组、阴性对照组和试验样品组至少使用5只小鼠。受试动物每日双耳背部府部给子2
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25μL供试液，连续3犬。对于只有极性供试液组，宜在处理前用丙酮擦拭耳背部皮肤，以帮助其吸收。7.3.2试验中，除了液体试验物质，应包括：极性和非极性阳性对照，极性和非极性浸提介质对照，试验样品的极性浸提液和试验样品的非极性浸提液：7.3.3对于液体试验物质，应包括：极性和非极性阳性对照，液体试验样品，和适用于液体样品特性的极性或非极性浸提介质对照。
7.3.4漫提液应在制备后24h内使用，并宜室温贮存。第2天和第3天分别处理，间隔24h土2h。表1描述了每天的试验内容。
7.3.5每观察每只小鼠试验部位的局部刺激征象以及全身毒性征象（见GB/T16886.10和GB/T16886.11）。如果怀疑器械/材料为刺激物，建议采用2只小鼠进行预试验。表1LLNA操作时间表
制备第1大使用的浸提液并准备第2天和第3天的浸提液小鼠称重、标记并用试验样品处理耳部观察小鼠并记录任何毒性或刺激体征，处理耳部观察小鼠并记录任何毒性或刺激体征，处理耳部观察小鼠并记录任何毒性或刺微体征观寨小鼠并记录任何毒性或刺激体征第3大处理小鼠后72h士3h，制备放射性同位素，观察小鼠的毒性或刺激体征、称重并静脉注射故射性同位索、注射后5h±54min，处死小鼠并制备淋巴结细胞，细跑淀18h制备细胞
放射性计数
数据分析
注：以下步骤到8.3.2直到沉淀18h的步骤需要至少81才能完成，实验室应具备这种条件，7.4放射性同位素示踪物的制备
7.4.1制备工作浓度的H-TdR2.96×10°Bg/mL（80μCi/mL）（体积分数），或用含10-mol/L氟脱氧尿甘的PBS制各2.96×10°Bg/mL（8μCi/mL）的13I-ITIDR。每只小鼠注射250μL，应附上所有使用放射性物质的标准警示信息。实验室应有操作放射性物质的资质并目所有人员经过适宜的培训和取得合格证书。
7.4.2将0.8mL的3.7×10°By（1.0mCi/mL)\HTdRL特定活性为7.4×10\°By/(mmol/L)2.0Ci/(mmol/L)放人一静置烧瓶中。加人无菌PBS至10mL。盖紧并充分混匀。7.4.3确认稀释液的浓度。在200mL的烧瓶中用水将0.08ml2.96×10Bg/mL(80pCi/mL)的HTdR稀释至200ml。盖紧颠倒混句几次。在闪烁管中加入两份1mL的样品。每管加人10mL的闪炼液，混合形成涡流，并在液闪计数器上计数。每管计数3次并计算平均值，计算浓度。每分钟计数(cpm）和每分钟衰变数（dpm）之间的转换如下式：cpm
dpm一干进制计数效率
为了验证\H-TdR工作溶液，测定其与2.96×10\Bg/mL(80μCi/mL)的接近程度。最终稀释液巾含1.18×10*B(0.032μCi)。因为1μCi=2220000dpm=3.7×10Bg，所以0.032μCi=7l040dpm=3
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1.18×10°Bq。因此：
工作溶液的Bq（uC
X295x10°Bg(80μCi)
调整所需液。如使用125I-IUDR，需进行相做的验正7.5原位标记
第6犬（耳部最后一次处理后72h士3h），精确记录每只小鼠的体重，使用1.0mL（不大于25标准刻度）书针注射器于每只小鼠一侧尾静脉注射250μL含7.4×10Bg（20μCi）H-TdR或7.4X10B(2uCi的-IUDR的无菌PBS8淋巴结收集和淋巴结细胞制备
注1：本部分所有器具和落波部直作为放射性物质来对待。注2：如果研究者熟悉淋结的位置，可参照ICCVAM文件中的图错，小鼠解剂书精或使用染色试验来定位合适建议鼠耳部皮内组织往射0.1mL2%的伊文思蓝，5min~10min后处死小鼠。解剖小鼠暴露的蒸日结
电面动物处死
注时放全间5上士4
8.2摘取耳引满林巴统
只小鼠双侧耳部引流淋巴结
从处死后小鼠内摘取每
8.3制备每只小鼠耳部淋巴结细胞的单细胞感液（LNC)8.3.1收集每只小鼠双侧引流淋巴结，并放人盛有1mL~3mLPBS的标记试验管中。用小剪刀将单只小鼠的淋巴结剪穿或直接放在200日筛网上轻轻研磨，收集入15mL的试管中。用2mL6mL的PIBS冲洗筛网以便将细胞碎片转移至试管巾中，重复操作1次，将试管中液体补是率10mL。注：如使用1作为标物，可不制备单细胞总液，立接用一计数仪进行计数。8.3.2在2℃~8℃条件下190g~200g离心样品10min。丢充上清并预留1mL~2ml，轻轻混勾细胞沉淀，用PBS补足至10mL涡旋震荡重悬。重复高心清洗步骤至少2次。最后1次清洗后，丢弃上清，并将细胞重感于3mL冰冷的5%TCA中，在2℃～8℃条件下沉淀18h士1h。8.4放射活性的测量
8.4.1在2℃~-8℃条件下，190g~200g离心沉淀细胞悬液10min。丢弃上清液并加入1mL新鲜制备的5%的TCA，涡旋震荡混匀。8.4.2将细胞悬液转移人一标记的含10mL液闪液的试管中，盖紧，充分震荡混匀。8.4.3制备2个试剂空白对照来测量H-TdR的背景水平。加人10mL液闪液和1ml.5%的TCA并充分混合。
8.4.4操拭所有试管的外部并放人液闪计数器。使试管暗适应30min，每管计数3次。9结果
9.1通过液闪计数器来测量每分钟每只小鼠H-TdR的掺入水平，并用cpm/小鼠来表示。或用-计4
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数仪来计数I125IUDR的掺人水平。用cpm值除以H-TdR的计数效率来得到dpm。计算每只小鼠的每管3次测量的dpm算术平均值，并减去试剂对照的dpru平均值。以dpm/小鼠表示，见7.4.3真实m=测量一背景
9.2计算每组5只小鼠dpm的算术平均值（X）和标准偏差（SD）。用试验样品组的平均dpm与阴性对照的dpm之比来计算刺激指数(SI)。10结果的评价和试验报告
10.1应用统计学方法来评价试验结果。t检验适合于参数数据，受-怀氏秋和检验适合于非参数数据。与阴性对照组相比，力<0.05被认为有统计学意义。10.2如果以下标准满足，则认为试验有效：每个阳性对照的SI3且显著大于供试液对照。附性对照的平均值与阴性对照的平均值和比，具有统计学意义。10.3试验报告应包括每只小鼠的体重数据、dp值、每组小鼠的平均值和标准偏差以及与供试液对照相比得出的每组小鼠的SI。应识别与供试液对照有显著统计学差异的值，10.4供试试验样品SI3被认为是致敏物。应使用统计学方法（t检验或曼怀氏秩和检验）来帮助评价试验结果。
10.5应对试验方法中给出的选择进行说明（如使用的浸提介质或放射性同位素）。10.6应分析实验开始和结束时每只小鼠的体重，特别是在评价浸提液毒性时，应注意体重的任何改变并将其包括在结果分析中。
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中华人民共和国医药行业标准
YY/T 0879.1-2013
医疗器械致敏反应试验
第1部分：小鼠局部淋巴结试验（LLNA）放射性同位素掺入法
Test for sensitization of medical devices-Part 1:Murine local lymph node assay (LLNA) : Radioisotopeincorporation method
2013-10-21发布
国家食品药品监督管理总局
2014-10-01实施
YY/T0879的总标题是《医疗器械致敏反应试验》，包括以下部分：第1部分：小鼠局部淋巴结试验（LLNA)放射性同位素掺人法有关其他方面的致敏反应试验将有其他部分的标准。本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草。YY/T0879.1—2013
YY/T0879的本部分参考ASTMF2148-2007《使用小鼠局部淋巴结试验（LLNA）评价发型接触性超敏反应的标准规范》制定。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家食品药品监督管理总局提出。本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会（SAC/TC248)归口。本部分主要起草单位：国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心。本部分参加起草单位：国家食品药品监督管理局北大医疗器械质量监督检验中心、上海生物材料研究测试中心。
本部分主要起草人：孙立魁、侯丽、刘成虎、韩建民、孙皎、陆华。YY/T 0879.1—2013
医疗器械的材料组分、加工助剂或消洗及灭菌残留物都可能诱发机体发生超敏反应。GB/T16886.10中推荐了三种测定医疗器械潜在皮肤致敏性的动物试验，包括豚鼠最大剂量试验（GPMT）、封闭式贴敷试验（Buchler试验）和小鼠局部淋巴结试验（LLNA）。GB/T16886.10未给出LI.NA方法步骤。
目前国际间已按受LLNA为豚鼠试验的唯一替代试验用于检验单一化学物，为化学物的首选测定法。与豚鼠致敏试验相比，LLNA具有以下优点：a）试验周期短。LLNA总周期为7天，而豚鼠致敏试验则需要24犬。b）所需试验动物较小。相比之下，LLNA更符合GB/T16886.2中动物福利要求。LLNA能得到刺激的定量反应数据，而非主观评价，可用丁剂量效应的测定，并提供可进行统计学分析的客观数据。
与豚鼠致敏反应相似，LLNA也是首选用于单一化学物致敏潜能的检测。LLNA检测了初期（诱导）的致敏过程，而豚鼠致敏试验则检测了后期（激发）的致敏过程。对不能渗透皮肤的某些金属和高分子量试验样品出现假阴性，假阳性的情况，可能需要豚鼠试验来评价其潜在的致敏性。YY/T0879的本部分中需要使用放射性同位素。因此，鼓励寻找放射性同位素的若代品，当新方法得到确认后，YY/T0879的本部分即可采用。
1范围
医疗器械致敏反应试验
第1部分：小鼠局部淋巴结试验（LLNA）放射性同位素掺入法
YY/T0879的本部分给出了医疗器械/材料致敏试验的检测方法YY/T0879.1——2013
本部分预期为豚鼠致敏试验提供一个替代性方法，无其适用于只接触完好皮肤的医疗器械/材料。然而，当评定金属材料或用于深部组织或损伤表面医疗器械产品/材料的致敏反应时，仍然推荐使用豚鼠致敏试验。
本部分只适用于能人皮肤的低分子量化学物，该吸收的化学物或代谢物可结合于大分子物质，如蛋白质以形成免疫原性复合物
2规范性引用文件此内容来自标准下载网
下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注自期的引用文件，仅注口期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用支件，其最新版本（包括所有的修改单）适用子GB/T16886.1
医疗器械生物学评价
GB/T16886.2医疗器械生物学评价文件。
第1部分，风险管理过稳中的评价与证验第2部分·动物福利要求
医疗器械生物学评价第10部分：期激与迟发型超敏反应试验GB/T1688610
GB/T16886.71
GB/T16886.12
3术语和定义
医疗器械生协学评价第1部分全身毒性试验医疗器械生物学评价第12部分，样品制备与参服样品GB/T16886.1、GB/T16886.2和（GB/T16886.10界定的术语和定义适用于本文件。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。，
A0O：丙酮橄榄油溶液（4：1体积比）DMSO二甲基亚矾
DNCB:2，4二硝基氯苯
ICCVAM：机构间替代方法评价协调委员会PBS:磷酸盐缓冲液(pH7.2)
TCA：5%三氟乙酸
H-TdR：\H-胸腺嘧啶核苷，7.4×10Bq/mm（2Ci/mM)(PBS)；1125IUI)R-112放射性尿嘧啶核苷
YY/T 0879.1—2013
5试验样品的制备
5.1宜根据GB/T16886.12推荐的原则制备试验样品。所有固体材料应进行浸提。应使用极性溶剂(水性）和非极性（非水性或有机)溶剂，如DMSO或AOO等进行浸提。5.2非刺激性液体试验样品和凝胶应直接使用。刺激性液体应根据液休试验样品的溶解度，使用极性或非极性溶剂进行稀释，直到溶液没有刺激性，5.3全水溶液不适用于耳部。因此，宜在每10mL极性对照和试验溶波中加人0.05g羟乙基纤维素以辅助溶波在耳部存留。
5.4用于浸提的试验样品它与器械最终使用的表面相一致。5.5样品应按照终产品灭菌的方法进行灭菌。5.6宜注意制样过程中不要污染样品，推荐使用无菌技术操作。注：LI.NA检验化学物一般采用剂量效应方式。医疗器械供试样品可能为浸提液，这种情况下仅有单剂量用于试验，一般可检验未稀释的浸提液。不过，当浸提液含有高毒性成分时，毒性在ILNA中可导致阴性反应。因此在LLNA中检验高毒性没提液（见GB/T16886.5)时，推荐采用剂量效应方式和释浸提液。6阳性对照的制备
6.1非极性阳性对照一称取0.025g的DNCB并放人烧瓶中。加人足量的DMSO完全溶解LNCB，加入DMSO补足10mL。盖住并摇见烧瓶直到获得均匀的溶液。阳性对照的剂量以临床观察中不产生全身毒性为宜。
6.2极性阳性对照一中性福尔马林可购买市售商品。（或用PBS稀释甲醛，甲醛体积为总体积的1/10。稀释方法：在10mL的烧瓶中改人1mL的甲醛。加人足量的PBS混合这两种溶液，另加PBS补足10m，盖任并摇见烧瓶直到获得内匀的溶液。）6.3极性溶液不适用丁耳部。因此，本试验中，在每10ml.极性阳性对照溶液中加人0.05g羟乙基纤维素以辅助溶液在耳部存留到吸收。6.4对所有需要浸提的样品，按照GB/T16886.12制备极性和非极性浸提渡（推荐使用DMSO或AOO，但也可使用ICCVAM文件所列出的其他浸提介质）。注：在经常进行LLNA时，在6个月或更长时间内的阳性反应具有良好的一致性，宜牟少每6个月进行一次阳性物对照实验。
7动物处理
7.1动物选择与饲养
宜使用7~12周龄、健康、术孕的雌性CBA/Ca或CBA/i小鼠，体重差异应低于平均休重的20%。其他适宜的实验动物品系如BALB/也可使用，但宜进行论证。根据处理分组，每笼5只饲养。所有的动物试验应在经国家认可机构批准并符合实验室动物福利全部适用法规的实验室内进行，并且还应符合GB/T16886.2的要求。
7.2试验前动物准备
第1天，检查并标记每组动物（不能使用耳部标记法）。精确称量每只小鼠的体重。7.3供试液处理动物
7.3.1阳性对照组、阴性对照组和试验样品组至少使用5只小鼠。受试动物每日双耳背部府部给子2
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25μL供试液，连续3犬。对于只有极性供试液组，宜在处理前用丙酮擦拭耳背部皮肤，以帮助其吸收。7.3.2试验中，除了液体试验物质，应包括：极性和非极性阳性对照，极性和非极性浸提介质对照，试验样品的极性浸提液和试验样品的非极性浸提液：7.3.3对于液体试验物质，应包括：极性和非极性阳性对照，液体试验样品，和适用于液体样品特性的极性或非极性浸提介质对照。
7.3.4漫提液应在制备后24h内使用，并宜室温贮存。第2天和第3天分别处理，间隔24h土2h。表1描述了每天的试验内容。
7.3.5每观察每只小鼠试验部位的局部刺激征象以及全身毒性征象（见GB/T16886.10和GB/T16886.11）。如果怀疑器械/材料为刺激物，建议采用2只小鼠进行预试验。表1LLNA操作时间表
制备第1大使用的浸提液并准备第2天和第3天的浸提液小鼠称重、标记并用试验样品处理耳部观察小鼠并记录任何毒性或刺激体征，处理耳部观察小鼠并记录任何毒性或刺激体征，处理耳部观察小鼠并记录任何毒性或刺微体征观寨小鼠并记录任何毒性或刺激体征第3大处理小鼠后72h士3h，制备放射性同位素，观察小鼠的毒性或刺激体征、称重并静脉注射故射性同位索、注射后5h±54min，处死小鼠并制备淋巴结细胞，细跑淀18h制备细胞
放射性计数
数据分析
注：以下步骤到8.3.2直到沉淀18h的步骤需要至少81才能完成，实验室应具备这种条件，7.4放射性同位素示踪物的制备
7.4.1制备工作浓度的H-TdR2.96×10°Bg/mL（80μCi/mL）（体积分数），或用含10-mol/L氟脱氧尿甘的PBS制各2.96×10°Bg/mL（8μCi/mL）的13I-ITIDR。每只小鼠注射250μL，应附上所有使用放射性物质的标准警示信息。实验室应有操作放射性物质的资质并目所有人员经过适宜的培训和取得合格证书。
7.4.2将0.8mL的3.7×10°By（1.0mCi/mL)\HTdRL特定活性为7.4×10\°By/(mmol/L)2.0Ci/(mmol/L)放人一静置烧瓶中。加人无菌PBS至10mL。盖紧并充分混匀。7.4.3确认稀释液的浓度。在200mL的烧瓶中用水将0.08ml2.96×10Bg/mL(80pCi/mL)的HTdR稀释至200ml。盖紧颠倒混句几次。在闪烁管中加入两份1mL的样品。每管加人10mL的闪炼液，混合形成涡流，并在液闪计数器上计数。每管计数3次并计算平均值，计算浓度。每分钟计数(cpm）和每分钟衰变数（dpm）之间的转换如下式：cpm
dpm一干进制计数效率
为了验证\H-TdR工作溶液，测定其与2.96×10\Bg/mL(80μCi/mL)的接近程度。最终稀释液巾含1.18×10*B(0.032μCi)。因为1μCi=2220000dpm=3.7×10Bg，所以0.032μCi=7l040dpm=3
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1.18×10°Bq。因此：
工作溶液的Bq（uC
X295x10°Bg(80μCi)
调整所需液。如使用125I-IUDR，需进行相做的验正7.5原位标记
第6犬（耳部最后一次处理后72h士3h），精确记录每只小鼠的体重，使用1.0mL（不大于25标准刻度）书针注射器于每只小鼠一侧尾静脉注射250μL含7.4×10Bg（20μCi）H-TdR或7.4X10B(2uCi的-IUDR的无菌PBS8淋巴结收集和淋巴结细胞制备
注1：本部分所有器具和落波部直作为放射性物质来对待。注2：如果研究者熟悉淋结的位置，可参照ICCVAM文件中的图错，小鼠解剂书精或使用染色试验来定位合适建议鼠耳部皮内组织往射0.1mL2%的伊文思蓝，5min~10min后处死小鼠。解剖小鼠暴露的蒸日结
电面动物处死
注时放全间5上士4
8.2摘取耳引满林巴统
只小鼠双侧耳部引流淋巴结
从处死后小鼠内摘取每
8.3制备每只小鼠耳部淋巴结细胞的单细胞感液（LNC)8.3.1收集每只小鼠双侧引流淋巴结，并放人盛有1mL~3mLPBS的标记试验管中。用小剪刀将单只小鼠的淋巴结剪穿或直接放在200日筛网上轻轻研磨，收集入15mL的试管中。用2mL6mL的PIBS冲洗筛网以便将细胞碎片转移至试管巾中，重复操作1次，将试管中液体补是率10mL。注：如使用1作为标物，可不制备单细胞总液，立接用一计数仪进行计数。8.3.2在2℃~8℃条件下190g~200g离心样品10min。丢充上清并预留1mL~2ml，轻轻混勾细胞沉淀，用PBS补足至10mL涡旋震荡重悬。重复高心清洗步骤至少2次。最后1次清洗后，丢弃上清，并将细胞重感于3mL冰冷的5%TCA中，在2℃～8℃条件下沉淀18h士1h。8.4放射活性的测量
8.4.1在2℃~-8℃条件下，190g~200g离心沉淀细胞悬液10min。丢弃上清液并加入1mL新鲜制备的5%的TCA，涡旋震荡混匀。8.4.2将细胞悬液转移人一标记的含10mL液闪液的试管中，盖紧，充分震荡混匀。8.4.3制备2个试剂空白对照来测量H-TdR的背景水平。加人10mL液闪液和1ml.5%的TCA并充分混合。
8.4.4操拭所有试管的外部并放人液闪计数器。使试管暗适应30min，每管计数3次。9结果
9.1通过液闪计数器来测量每分钟每只小鼠H-TdR的掺入水平，并用cpm/小鼠来表示。或用-计4
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数仪来计数I125IUDR的掺人水平。用cpm值除以H-TdR的计数效率来得到dpm。计算每只小鼠的每管3次测量的dpm算术平均值，并减去试剂对照的dpru平均值。以dpm/小鼠表示，见7.4.3真实m=测量一背景
9.2计算每组5只小鼠dpm的算术平均值（X）和标准偏差（SD）。用试验样品组的平均dpm与阴性对照的dpm之比来计算刺激指数(SI)。10结果的评价和试验报告
10.1应用统计学方法来评价试验结果。t检验适合于参数数据，受-怀氏秋和检验适合于非参数数据。与阴性对照组相比，力<0.05被认为有统计学意义。10.2如果以下标准满足，则认为试验有效：每个阳性对照的SI3且显著大于供试液对照。附性对照的平均值与阴性对照的平均值和比，具有统计学意义。10.3试验报告应包括每只小鼠的体重数据、dp值、每组小鼠的平均值和标准偏差以及与供试液对照相比得出的每组小鼠的SI。应识别与供试液对照有显著统计学差异的值，10.4供试试验样品SI3被认为是致敏物。应使用统计学方法（t检验或曼怀氏秩和检验）来帮助评价试验结果。
10.5应对试验方法中给出的选择进行说明（如使用的浸提介质或放射性同位素）。10.6应分析实验开始和结束时每只小鼠的体重，特别是在评价浸提液毒性时，应注意体重的任何改变并将其包括在结果分析中。
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