YY/T 0127. 10-2001.Biological evaluation of dental materials-Part 2:Biological evaluation test method of dental materials-Salmonella typhimurium reverse mutation assay (Ames mutagenicity test).
5.3增菌培养
从冷冻贮存菌株管中刮取细菌置5 mL营养肉汤培养基中,经37C振荡(100次/min)培养10~12h,活菌数应达10°个/mL(或ODos≈0.4)。细菌培养液从37C取出后,应立即放人冰浴中备用。试验需用当天孵育好的新鲜细菌。
5.4菌株鉴定
5.4.1组氦酸需求(his- )试验
凡组氨酸营养缺陷型试验菌株只能在补充组氨酸的培养基上生长,而在缺乏组氨酸的培养基上不能生长。
鉴定方法:在底层培养基平m表面加入0.5 m mol/L L-组氨酸0.1 mL和0.5 m mol/L D-生物素0.1mL.用L.棒铺开。对照平皿只加生物素不加组氨酸。用白金耳浸细菌培养液,在对照平皿和含有组氨酸/生物素的平皿表面分别平行划线。四株细菌可划在同一个平皿上,经37C孵育24 h后,观察细菌生长情况。试验菌株在含组氨酸平皿上生长,在对照平皿上不应生长。
5.4.2脂多糖屏蹄缺陷鉴定(rfa突变)
粗糙型突变的微生物,其细胞表面一层脂多糖屏障已经破坏,因此一些大分子物质能穿过菌膜进人.菌体内而抑制其生长。野生型茵株或含gal缺失的菌株则不受影响。鉴定方法:分别将每种细菌培养液0.1 mL加到45C 2 mL顶层培养基试管内,混匀后倾倒于营养琼脂培养基平皿表面,使其均匀分布。待固化后,取直径为6mm无菌滤纸圆片浸1mg/mL结晶紫溶液10pL,放到平皿中央。经37C孵育24h后,围绕四纸片出现透明的抑菌环(直径大约14mm),说明此菌存在深粗型(rfa)突变。TA 97.TA 98.TA 100、TA 102均有抑菌环。野生型鼠伤寒杆菌无抑菌环。
5.4.3对紫外线敏感性鉴定(uvrB修复缺陷型的容定)
具有uvrB修复缺陷型的试验菌株,在紫外线照射后仍能照常生长,借此证明uvrB突变的存在。鉴定方法:用白金耳没细菌培养液,在营养琼脂培养基平皿表面平行划线,四株细菌可划在同一平皿上。用黑纸覆盖平皿一半,在距离33cm处用15 W紫外线杀菌灯照射平皿8s.经37C孵育24h后观察结果。对紫外线墩感的園株(TA 97.TA 98,TA 100)只在未照射过的一半平皿上生长。而具有uvrB .修复缺陷型的菌株(TA102)在紫外线照射(未盖黑纸的另一半平皿)后仍能生长。
5.4.4抗氨苄 青霜索(PKM101)试验(菌株R因子丢失鉴定)
含R因子的试验菌株对氨苄青霍索具有抗性。R因子不稳定容易丢失，从而使试验菌株丧失R因子的特性,故需鉴定R因子是否存在.
鉴定方法1:用白金耳没细菌培养液,在含氨苄青霉索平皿表面平行划线,四株细菌可划在同-平皿上。还应选用一个无抗性因子的蘭株。以测定氦苄青霉素的效应。经37C孵育24h后,无抗性因子菌株不应生长。
鉴定方法2:用白金耳没细菌培养液，在营养琼脂培养基平皿表面平行划线,四株细菌可划在同一平皿上。将沾有氦苄青霉素溶液的滤纸条与划线交叉故置,37C孵育24h.如滤纸条周围细菌生长正常。说明试验菌株具有R因子。
5.4.5四环索(PAQI)抗性的鉴定

备案号：8599-2001
中华人民共和国医药行业标准
YY/T0127.10-2001
口腔材料生物学评价
第2单元：口腔材料生物试验方法鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验（Ames试验）
Biological evaluationof dental materialsPart 2:Biological evaluation test method of dental materialsSalmonellatyphimuriumreversemutationassay(Amesmutagenicitytest)
2001-03-12发布
国家药品监督管理局发布
2001-08-01实施
YY/T0127.10—2001
本标准主要依据GB15193.4—1994《食品安全性毒理学评价程序和方法》以及GB7919—1987《化妆品安全性评价程序和方法》而制定。本标准废除并代替YY91042--1999《牙科复合树脂充填材料》附录AA3鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验（Ames试验）。本标准与前版标准在主要技术内容上无差别，仅对操作步骤操作于以细化，并进行了编辑性修改。
本标准为YY0268--1995《口腔材料生物学评价第1单元：口腔材料生物性能评价导则》提供了具体的试验方法。
本标准从实施之日起，同时代替YY91042一1999《牙科复合树脂充填材料》附录AA3鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验（Ames试验）。本标准的附录A是标准的附录。
本标准由国家药品监督管理局提出。本标准由全国口腔材料和器械设备标准化技术委员会归口。本标准由国家药品监督管理局北医医疗器械质量监督检验中心负资起草。本标准主要起草人：林红、刘文一、李盛琳。1范围
中华人民共和国医药行业标准
口腔材料生物学评价
第2单元：口腔材料生物试验方法伤寒沙门氏杆菌回复突变试验
（Ames试验）
Biological evaluation of dental materialsPart 2.Biological evaluation test method of dental materials-Salmonella typhimurium reverse mutation assay(Ames mutagenicitytest)
本标准规定了口腔材料鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验方法。YY/T 0127.10—2001
代替YY91042--1999
附录AA3
本试验用于测定可引起沙门氏杆菌基因置换和/或移码突变的口腔材料所诱发的依赖于组氨酸(his一）的菌株产生不依赖于组氨酸(his十）的基因突变。为检测口腔材料的诱变性试验之一2引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB7919—1987化妆品安全性评价程序和方法GB15193.41994食品安全性毒理学评价程序和方法YY/T0127.2—1993口腔材料生物试验方法：静脉注射急性全身毒性试验ISO7405—1997牙科学—
用于牙科的医疗器械生物相容性临床前评价3仪器
3.1实验室常用设备
牙科材料试验方法
3.2洁净工作台，恒温培养箱，恒温水浴，低温高速离心机，低温冰箱（一80℃）或液氮罐等。4培养基和试剂的制备
培养基和试剂的制备见附录A。
5菌株准备、鉴定和贮藏
5.1蘭株
采用组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌共四株一TA97、TA98.TA100、TA102。5.2菌株贮存
菌抹贮存在加有二甲基亚砜的（光谱纯）新鲜细菌培养液中，其体积比为0.09：1，混合后分装于小国家药品监督管理局2001-03-12批准2001-08-01实施
YY/T0127.10—2001
试管或菌种管内，经干冰丙酮液（—75℃）或液氮（-196℃）速冻，在-80℃冰箱或--196℃液氮中长期贮存。
5.3增菌培养
从冷冻贮存菌株管中刮取细菌置5mL营养肉汤培养基中，经37C振荡（100次/min）培养10~12h，活菌数应达10个/mL（或ODg~0.4）。细菌培养液从37C取出后，应立即放人冰浴中备用。试验需用当天孵育好的新鲜细菌。
5.4菌株鉴定
5.4.1组氨酸需求(his-)试验
凡组氨酸营养缺陷型试验菌株只能在补充组氨酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上不能生长。
鉴定方法在底层培养基平皿表面加人0.5mmol/LL-组氨酸0.1mL和0.5mmol/LD-生物素0.1mL。用L棒铺开。对照平血只加生物索不加组氨酸。用白金耳浸细菌培养液，在对照平血和含有组氮酸/生物素的平血表面分别平行划线。四株细菌可划在同一个平迅上，经37C孵育24h后，观察细菌生长情况。试验菌株在含组氨酸平上生长，在对照平血上不应生长。5.4.2脂多糖屏障缺陷鉴定(rfa突变）粗糙型突变的微生物，其细胞表面一层脂多糖屏障已经破坏，因此一些大分子物质能穿过菌膜进人菌体内而抑制其生长。野生型菌株或含gal缺失的菌株则不受影响。鉴定方法：分别将每种细菌培养液0.1mL加到45℃2mL顶层培养基试管内，混勾后倾倒于营养琼脂培养基平血表面，使其均匀分布。待固化后，取直径为6mm无菌滤纸圆片浸1mg/mL结晶紫溶液10μL，放到平皿中央。经37℃孵育24h后，围绕圆纸片出现透明的抑菌环（直径大约14mm），说明此菌存在深粗型（rfa）突变。TA97、TA98TA100、TA102均有抑菌环。野生型鼠伤寒杆菌无抑菌环。5.4.3对紫外线敏感性鉴定（uvrB修复缺陷型的鉴定）具有uvrB修复缺陷型的试验菌株，在紫外线照射后仍能照常生长，借此证明uvrB突变的存在。鉴定方法：用白金耳浸细菌培养液，在营养琼脂培养基平Ⅲ表面平行划线，四株细菌可划在同一平Ⅲ上。用黑纸双盖平血半，在距离33cm处用15W紫外线杀菌灯照射平Ⅲ8s，经37℃C孵育24h后观察结果。对紫外线敏感的菌株（TA97、TA98、TA100)只在未照射过的一半平血上生长。而具有uVrB修复缺陷型的菌株(TA102)在紫外线照射（未盖黑纸的另一半平Ⅲ)后仍能生长。5.4.4抗氨苄青舞索（PKM101)试验（菌株R因子丢失鉴定）含R因子的试验菌株对氨芊青霉素具有抗性。R因子不稳定容易丢失，从面使试验菌株丧失R因子的特性，故需鉴定R因子是否存在。鉴定方法1：用白金耳浸细菌培养液，在含氨苄青靠索平Ⅲ表面平行划线，四株细菌可划在同一平血上。还应选用个无抗性因子的菌株，以测定氨苄青索的效应。经37C孵育24h后，无抗性因子菌株不应生长。
鉴定方法2：用白金耳浸细菌培养液，在营养琼脂培养基平皿表面平行划线，四株细菌可划在同一乎皿上。将沾有氮芊青霉素溶液的滤纸条与划线交叉放置，37C孵育24h。如滤纸条周围细菌生长正带，说明试验葡株具有R因子。
5.4.5四环素（PAQI)抗性的鉴定鉴定方法1：用白金耳浸细菌培养液，在含氨芋青霉素/四环素平皿表面平行划线，四株细菌可划在同一平Ⅲ上。经37℃C孵育24h后，对四环素有抗性的TA102菌株能生长，对四环素无抗性的菌株不生长。
鉴定方法2：用白金耳浸细菌培养液，在营养琼脂培养基平皿表面平行划线，四株细菌可划在同一平血上。待干后，吸取四环索（8mg/mL)溶液与菌株划线处交叉划线，37C孵育24h。对四环素有抗性的TA102菌株能生长，其他菌株不生长。2
5.4.6自发回变数（his+）的测定YY/T0127.10—2001
在小试管中加人融化的顶层培养基2mL，分别加入待测菌株的菌液0.1mL，迅速在高速液体混合器上混勾，倾倒在已固化的底层培养基平Ⅲ上，使其均匀分布。待固化后，经37C孵育48h，计数全部菌落数。一个菌株应做2一3个平血，以便计算平均菌落数。必要时可重复试验，以保证回变菌落数值在一个恒定的范围。各试验菌株的自发回变数分别为：TA97（97～180)：TA98（15~60）：TA100（75～200）：TA102(240～360)。加过S-9的菌株，自发回变数稍有增加。5.4.7对阳性突变剂的敏感性鉴定使用已知阳性对照剂.检查试验菌株的敏感性是否降低，其方法同7。6代谢活化剂[大鼠肝微粒体酶(S-9)的诱导和制备6.1大鼠肝微粒体酶（S-9）的诱导选用体重150～200g的健康雄性S-D大白鼠或体重110~150g的Wistar大鼠。将多氯联苯（Aro-clor1254或国产PCB-五氛）溶于玉米油中，浓度为200mg/mL，腹腔一次注射500mg/kg（体重）。第6天用颈动脉排空血液法处死，处死前12h禁食不禁水。6.2切取肝脏
处死的大鼠经过无菌处理，打开腹腔，用20mL0.15mol/L氯化钾液（4C）进行肝门静脉灌注后，小心分离并将肝脏完整取出，整个过程应在无荫室中进行。离体以后的肝始终保持4℃以下无菌操作。
6.3S-9的制备
制备S-9的一切器Ⅲ均应消毒，全部操作在冰水浴中进行。肝脏称重后，在0.15mol/L氯化钾溶液中洗涤数遍。每克重肝脏加0.15mol/L氯化钾溶液3mL。用剪刀剪碎肝脏，放人组织匀浆机中，以4000r/min匀浆2min。将匀浆液放入低温（0～4℃）高速离心机上，以9000g离心10min，其上层液即S-9。6.4S-9贮存
吸取2mL上层液分装于小试管或安中。在密封的条件下，用干冰丙酮液速冻后.贮存于一80℃冰箱或液氮容器中。保存期不超过一年。6.5S-9鉴定
S-9制备后，应进行下列测定：
a）无菌检查；
b）蛋白含量测定（Lowry法）每毫升蛋白含量应不超过40mg。c）细胞色素P-450测定；
S-9活力还必须以标准致癌物进行测定。6.6S-9的剂量选择
首先使用标准浓度的S-9混合液，测定其对已知阳性致瘤物的生物活性，确定最适用量。如果是阴性结果，还应使用高浓度的S-9混合液重新试验。6.7S-9混合液制备：见附录AA8。受试样品的制备
试样制备可选用生理盐水、二甲基亚砜（DMSO）或其他溶剂（毒性剂量以下），无论选用何种溶剂，均应无诱变性。将材料制备成溶液、混悬液或浸提液。浸提液制备按YY/T0127.2规定的方法进行。7.1受试样品剂量选择预试验
用菌株TA100进行预试验（操作程序应与正式试验一致），以了解受试样品对细菌的毒性。YY/T0127.10—2001
决定受试样品的最高剂量的标准是细胞毒性和溶解度。细胞毒性表现是：平血中回复突变菌落数减少，背景菌苔变清晰：40倍显微镜下背景菌苔稀疏，体积增大等。毒性大的受试样品，选择有轻微毒性的剂量作为试验的最高剂量。毒性小、溶解度高的受试样品，最高剂量溶液50mg/mL，混悬液100mg/mL，浸提液200mg/mL。
每种受试样品至少设五个剂量。8诱变试验方法
一次试验最少设5个剂量组及阴性（溶媒）对照组和阳性对照组，代谢活化和非代谢活化两种测试过程应同时进行。试验结果在有背景菌苔存在情况下，计算每个平Ⅲ的回变菌落数，并需重复试验1～2次。
8.1预培养法
分别取0.1mL受试样品液、0.5mLS-9混合液（需代谢活化时加。不需代谢活化时加0.5mL不含S-9的磷酸缓冲液）、0.1mL细菌培养液。将三者移人无菌小试管内混合，在37C振荡培养20min，再加人2mL项层培养基，混匀后倾倒在底层培养基平皿上，使之均匀分布。待固化后，将平皿翻转，经37℃孵育48h观察结果。
8.2平板掺人法
将含0.5mmol/L组氨酸生物索的顶层培养基2mL分装于小试管中，45C恒温水浴中保温，每管再依次加人0.1mL受试样品液，0.1mL细菌培养液和0.5mLS-9混合液（需代谢活化时加。不需代谢活化时加0.5mL不含S-9的磷酸缓冲液），混匀后倾倒在底层培养基平皿上并使之均匀分布。待固化后，将平皿翻转、经37℃孵育48h观察结果。9结果评定
记录试验组和对照组的每一平血的回变菌落数，每个试验组的回变菌落数以平均值和标准差（X士SD)表示。
受试样品的回变菌落数高于阴性对照回变菌落数的二倍以上，并有剂量-效应关系或某一个或某几个剂量点的可重复性，并有统计学意义的阳性反应，则判为诱变阳性。A1顶层培养基
氯化钠
蒸馏水
YY/T0127.10—2001
附录A
（标准的附录）
培养基和试剂的制备
加热溶化后，加人0.5mmol/L组氨酸-生物素溶液20mL。121℃104kPa20min高压灭菌。A2底层培养基
蒸馅水
121℃C104kPa20min高压消毒后，趁热（80C）在其内依次加人50X（V-B）培养基E10mL和40%葡糖溶液25mL，混匀，按每血30mL倒平皿，冷凝固化后倒置于37C培养箱中24~48h。A3Vogel-Bonner(V-B)培养基E(50X)硫酸镁（MgSO。·7HO)
构枸橼酸(CH.O,H,O)
磷酸氢二钾（K,HPO,）
磷酸氢铵钠（NaNH,HPO,·4H,O）加蒸馅水至100mL
先将后三种溶解后，再加人硫酸镁，待完全溶解后，分装于锥形瓶里，121C104kPa20min高压消毒。
A440%葡萄糖溶液
称取40g葡药糖，加人蒸馏水至100mL，115℃69kPa20min高压消毒。4℃保存，A5营养肉汤培养基
牛肉膏
胰陈（或混合蛋白陈）
氯化钠
磷酸氢二钾
蒸馏水
加热解，调pH至7.4，121℃104kPa20min高压消毒。4C保存。A6营养肉汤琼脂培养基
琼脂粉
肉汤培养基
加热济化后，调pH至7.4，121℃104kPa20min高压消毒后，倒斜面或平血。用于菌株鉴定、细菌活力鉴定或常规试验用菌株保存。5
A70.5mmol/L组氨酸-生物素溶液D-生物素（分子最247.3）
L-组氢酸盐（分子量191.7）
加蒸馏水至
YY/T0127.10—2001
121℃104kPa20min高压消毒。4C保存。A8S-9混合液配制（按每毫升S-9混合液计算）表A1
标准浓度
大鼠肝S-9
0.4mol/LMgCl2-1.5mol/LKCI盐溶液0.2mol/L6-磷酸葡萄糖
0.2mol/L辅酶/
0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)
无菌蒸增水
混勾，置冰浴中待用
40 μL
20 μL
20 μL
500μL
395 μL
A9MgClz-KCI盐溶液（1.65mol/LKCl+0.4mol/LMgCl2)氯化钾(KCI)
氯化镁（MgClz·6H,O）
蒸馏水加至
121C104kPa20min高压消毒
A100.2mol/L辅酶II(NADP）溶液NADP（分子量765.4）
蒸馏水（无菌）
无菌条件下配制，分装于EP管中，一20C保存。A110.2mol/L6-磷酸葡萄糖(G-6-P)溶液G-6-P钠盐（分子量304.1）
蒸馏水（无菌）
无菌条件下配制，分装于EP管中，一20C保存。A120.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4)磷酸二氢钠（NaH,PO·2H,O)（28.4g/L）磷酸氢二钠（NaHPO·12HO）（27.6g/L）121C104kPa20min高压消靠。4℃保存。A130.15mol/L氯化钾溶液
高涨度
20 μL
20 μl
500μl
335μL
精确称取氮化钾11.18g?用蒸馏水稀释至1000mL，121C104kPa30min高压消毒，冷却后冰箱保存，用于S-9制备。
A14氨芒青萄素溶液（8mg/mL）
YY/T0127.10—2001
称取三羟氮青辑紫80mg，加人0.02mol/L氢氧化钠溶液10mL。无菌配制，4℃保存。A150.1%结晶紫溶液
称取结晶紫10mg，加10mL无菌水，4℃保存。A16四环素溶液（8mg/mL）
称取四环素40mg，加人0.02mol/L盐酸溶液5mL，用于四环素抗性试验。无菌配制，4℃保存。YY/T 0127.10-2001bZxz.net
中华人民共和国医药
行业标准
口腔材料生物学评价
第2单元：口腔材料生物试验方法鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验（Ames试验）
YY/T0127.10—2001
中国标准出版社出版
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