ICS 65.020.30 B 40 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 826—2004 绵羊胚胎移植技术规程 Regulation for sheep embryo transfer 2004-08-25发布 2004-09-01实施 中华人民共和国农业部 发布 前言 本标准的附录A、附录B、附录C、附录D为规范性附录。本标准由国家农业部农垦局提出。本标准起草单位：新疆农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：有国庆、杨水林、倪建宏、皮文解、陈静波、周平、万鹏程。 1 范围 本标准规定了绵羊胚胎移植技术操作的基本原则、要求和方法。本标准适用于绵羊胚胎移植技术推广应用的规范化操作。山羊胚胎移植操作也可参照本规程。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 卵 ovum 母羊在性成熟时卵巢所排出的具有繁殖能力的细胞。 2.2 胚胎 embryo 卵经精子授精后称之为胚胎。 2.3 超数排卵 superovulation 指在母羊发情周期的适当时间，注射外源促性腺激素，使卵巢中比在自然情况下有较多的卵泡发育并排卵的一项技术。 3 供体羊处理 3.1 供体羊的选择 a) 供体羊应符合品种标准； b) 供体羊健康、无疾病； c) 繁殖机能正常。 3.2 超数排卵时间 a) 应在每年绵羊最佳繁殖季节进行； b) 在自然发情或诱导发情的第12 d～13 d进行。 3.3 超数排卵处理 3.3.1 促卵泡素(FSH)递减处理法 在自然发情或诱导发情的第12 d～13 d开始肌肉注射FSH，早、晚各一次，间隔12 h，分3 d递减注射（见表1）。 使用国产FSH总剂量为200 IU～300 IU。山羊的超数排卵可在发情周期的第17天开始，国产促卵泡素用150 IU～250 IU，或用PMSG 1000 U～2000 U，其他操作与绵羊相同。 表1 超数排卵方法示意图 时间：d | 剂量：IU | 说明 ---|---|--- 发情 | - | - 13 d | FSH 75 | 每12 h注射1次 14 d | FSH 50 | 每12 h注射1次 15 d | FSH 25 | 每12 h注射1次 发情 | - | 人工输精 2 d - 3 d | - | 输卵管采卵 7 d | - | 子宫采卵 3.3.2 孕马血清促性腺激素(PMSG)和抗孕马血清促性腺激素(aPMSG)处理法 在自然发情或诱导发情的第12 d～13 d，一次肌肉注射PMSG 150 IU～2500 IU。发情后18 h～24 h肌肉注射等量的aPMSG。 3.4 人工授精 动物母羊均表现发情，于当日下午各人工授精一次。因母羊为超排处理，有多个卵子排出，因而需加大输精量。用原精的0.2 mL（含4亿个精子）/次，直至发情结束。 4 胚胎采集 4.1 采卵时间 以发情日为0 d，在6 d～7.5 d或2 d～3 d内，用手术法分别从子宫和输卵管回收胚胎。 4.2 手术室设置及要求 采卵及胚胎移植需在专门的手术室内进行。 4.3 器械、冲卵液等物品的准备 4.3.1 手术用的金属器械放在含0.5%硫酸钠（作为防污剂）的0.1%新洁尔灭液中浸泡30 min，或在来苏儿液中浸泡1 h。 4.3.2 玻璃器皿、敷料和创巾等物品消毒按此规程附录B执行。 4.3.3 经灭菌的冲卵液置于37℃水浴加温，玻璃器皿置于38℃培养箱内待用。 4.3.4 麻醉药、消炎药和抗生素等药物，以及酒精棉、碘酒棉等物品备齐。 4.4 供体羊准备 供体羊手术前应禁食24 h～48 h，供给适量饮水。 4.4.1 供体羊的保定和麻醉 供体羊仰卧在手术架，固定四肢，肌肉注射2%静松灵0.5 mL，局部用0.5%盐酸普鲁卡因麻醉。 4.4.2 手术部位及其消毒 手术部位一般选择乳房前腹中线部（在两条乳静脉之间）或后肢股内侧腹股沟部。剪毛消毒。 4.5 术者的准备 术者需穿无菌手术服，戴工作帽和口罩，手臂要消毒。 4.6 手术操作的基本要求 手术操作要求细心谨慎、熟练。 4.6.1 手术分离 4.6.1.1 做切口注意要点：避开较大血管和神经。 4.6.1.2 切开皮肤。 4.6.1.3 切开皮下组织。 4.6.1.4 切开肌肉。 4.6.1.5 切开腹膜。 4.6.2 止血 4.6.2.1 毛细管止血。 4.6.2.2 小血管止血。 4.6.2.3 较大血管止血。 4.7 采卵方法 4.7.1 输卵管法 供体羊发情后2 d～3 d采卵，用输卵管法将冲卵管端出输卵管伞部的喇叭口插入，约2 mm～3 mm深（打活结或用钝圆的夹子固定），端接集卵皿。用注射器吸取37℃的冲卵液5 mL～10 mL，在子宫角靠近输卵管的部位将针头朝输卵管方向扎入。操作时，一只手指在针头方向后侧紧按宫角，另一只推注射器，冲卵液由子宫管结合部流入输卵管，经输卵管流至集卵皿。 4.7.2 子宫法 供体羊发情后6 d～7.5 d采卵。用这种方法手术将子宫暴露于创表前后，用套有胶管的肠钳夹在子宫角分叉处。注射器吸入预热的冲卵液20 mL～30 mL（备用液50 mL～60 mL），冲卵针头（钝形）从子宫角尖端插入，当确认针头在管腔内、进退通畅时，将硅胶管连接在注射器上。推注冲卵液，当子宫角膨胀时，将回收卵针头从肠钳钳夹基部的上方迅速扎入，冲卵液经硅胶管收集于烧杯内。最后用两手拇指和食指将子宫角一侧按压，子宫角用同样方法冲洗。进针时，避免损伤血管；推注冲卵液时力量和速度应适中。 4.7.3 冲卵管法 用手术法取出子宫，在子宫体扎孔，将冲卵管插入，使球在子宫角分叉处，使冲卵管尖端靠近子宫角前端。用注射器注入气体8 mL～10 mL，然后进行灌流，分次冲洗子宫角，每次灌注10 mL～20 mL，备用液约50 mL～60 mL。冲完后将球放下，冲卵管插入另一侧，用同样方法冲卵。 4.8 缝合 缝合按常规手术方法进行。 4.9 术后处理 采卵完毕后，用37℃灭菌生理盐水湿润母羊子宫，冲去凝血块，再涂少许灭菌液体石蜡，将器官复位。腹膜、肌肉缝合后，撒一些碘胺粉等消炎防腐药。皮肤缝合后，在伤口周围涂碘酒，再用酒精做最后消毒。供体羊肌肉注射青霉素（80万IU）和链霉素（100万IU）。 5 胚胎检出 5.1 检胚操作要求 检胚者应熟悉体视显微镜的结构，做到熟练使用。 5.2 找卵要点 根据胚胎的比重、大小、形态和透明带折光性等特点找胚胎。 5.3 检胚前的准备 5.3.1 待检的胚胎应保存在37℃条件下，尽量减少体外环境、温度、灰尘等因素的不良影响。 5.3.2 在酒精灯上拉制内径为300 μm～400 μm的玻璃吸管和玻璃针。每个冲卵供体羊需备3个～4个培养皿，编好号，放入培养箱备用。 5.4 检胚方法及要求 用玻棒清除胚胎外围的黏液、杂质，将胚胎吸至第一个培养皿内。吸管先吸入少许磷酸缓冲液（PBS，配制方法见附录A），再吸入胚胎。在培养皿的不同位置冲洗胚胎3次～5次。 6 胚胎的鉴定和分级 6.1 胚胎的鉴定 6.1.1 在20倍～40倍体视显微镜下观察受精卵的形态、色调、分裂球的大小、均匀度、细胞的密度与透明带的间隙以及变性情况等。 6.1.2 凡卵裂的卵黄未形成分裂球及细胞团的，均列为未受精卵。