ICS65.120 B54 备案号：浙江省地方标准 DB33/T745-2009 饲料中甲基睾丸酮的测定 高效液相色谱法 2009-04-07 发布 2009-05-07 实施 浙江省质量技术监督局发布 前言 本标准由浙江省海洋与渔业局提出并归口，起草单位为浙江省水产质量检测中心。主要起草人包括王扬、叶磊海、宋、张海琪、郑重莺、马文俊、何丰。本标准附录A为资料性附录。 1 范围 本标准规定了饲料中甲基睾丸酮的液相色谱测定方法，适用于配合饲料中甲基睾丸酮的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。注日期的引用文件仅适用于所注日期的版本；未注日期的引用文件适用于最新版本。 - GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 - GB/T14699.1 饲料采样 3 原理 用甲醇水溶液提取饲料中甲基睾丸酮，石油醚脱脂，固相萃取柱净化，高效液相色谱法检测，外标法定量。 4 试剂与材料 本标准所用试剂除特别注明外，均为分析纯。实验用水应符合GB/T6682二级水标准。 4.1 甲醇：色谱纯。 4.2 石油醚。 4.3 磷酸。 4.4 95%甲醇溶液：95mL甲醇与5mL水混匀。 4.5 磷酸水溶液：1mL磷酸加入600mL水混匀。 4.6 甲基睾丸酮（C20H30O）：质量分数≥99.0%。 4.7 标准储备液：甲基睾丸酮0.0100g溶于甲醇制1.0mg/mL，4℃保存，有效期6个月。 4.8 标准工作液：临用时用流动相稀释成各浓度标准溶液。 4.9 中性氧化铝固相萃取柱：3mL，500mg。 4.10 滤膜：四氟乙烯膜，孔径0.45μm。 5 仪器与设备 5.1 液相色谱仪：配紫外检测器。 5.2 电子分析天平：感量0.01g和0.0001g。 5.3 标准筛：孔径1mm。 5.4 恒温振荡器。 5.5 离心机：5000r/min。 5.6 氮气吹干仪。 5.7 固相萃取装置。 5.8 旋涡混匀器。 5.9 聚丙烯离心管：50mL。 5.10 玻璃离心管：10mL。 6 色谱条件 6.1 色谱柱：C18，5μm，250mm×4.6mm（i.d）。 6.2 柱温：30℃。 6.3 流动相：甲醇+磷酸水溶液=72:28。 6.4 流速：0.8mL/min。 6.5 进样量：20μL。 6.6 检测器波长：254nm。 7 分析步骤 7.1 试样制备 按GB/T14699.1选取代表性样品200~500g，四分法缩至100g，粉碎至全部通过1mm筛，充分混匀，贮于磨口瓶中干燥避光保存。 7.2 提取 称取约5.00g试样于50mL聚丙烯离心管中，加入20mL甲醇水溶液和5mL石油醚，剧烈振荡1min后于恒温振荡器30℃提取15min，5000r/min离心10min，弃上层石油醚，准确吸取甲醇水溶液层2mL于10mL玻璃离心管中，再加0.3mL水。 7.3 净化 加3mL石油醚至离心管中，旋涡振荡1min，静置分层，弃上层石油醚。下层甲醇液经中性氧化铝柱净化，用2mL甲醇冲洗柱，冲洗液并入离心管，40℃下氮气吹干，用1.0mL流动相定容，经滤膜过滤，上机分析。超出线性范围可稀释测定。 7.4 工作曲线 注入20μL浓度0.05~5.0μg/mL标准工作液，高效液相色谱分析，以峰面积为纵坐标，标准样品甲基睾丸酮含量为横坐标绘制工作曲线。 7.5 色谱测定 取试样滤液20μL进样，记录峰面积，响应值应在标准曲线线性范围内，根据标准品保留时间定性，外标法定量。 8 结果计算与表述 试样中甲基睾丸酮含量按公式计算：X = C × V / m，其中X为试样中甲基睾丸酮含量，C为测得浓度，V为定容体积，m为试样质量。