《大豆根瘤菌竞争结瘤能力与固氮效果评价技术规程》DB23/T3169—2022，本文件规定了大豆根瘤菌竞争结瘤能力与固氮效果评价的术语和定义、结瘤能力评价方法、固氮效果评价方法。 本文件适用于外源接种大豆根瘤菌的效果评价。 1. 范围 本标准规定了大豆根瘤菌竞争结瘤能力与固氮效果评价技术的术语和定义、结瘤能力评价与固氮效果评价的方法。 2. 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款： GB/T19495.2《转基因产品检测实验室技术要求》 GB/T19495.3-2004《转基因产品检测核酸提取纯化方法》 NY/T2066-2011《微生物肥料生产菌株的鉴别聚合酶链式反应（PCR）法》 3. 术语和定义 3.1 占瘤率 指应用特定根瘤菌株接种豆科植物与土著根瘤菌竞争结瘤，在竞争中，特定根瘤菌结瘤数占总瘤数的百分比，称为占瘤率，是评估接种根瘤菌相对于土著根瘤菌竞争结瘤能力的重要参数。 3.2 竞争结瘤能力 指根瘤菌在宿主豆科植物上形成根瘤，并且能够在其他根瘤菌存在的情况下，与其他根瘤菌竞争结瘤的能力。 3.3 固氮能力 固氮能力是根瘤菌将分子态氮还原成氨和其他含氮化合物的能力，通过对比接种待测菌株与未接种处理的根瘤固氮酶活性和植株全氮含量来评价。 4. 结瘤能力评价 4.1 一般要求 实验室操作人员应具备良好的分子生物学专业技能，操作熟练。实验中应符合GB/T19495.2的安全要求。 4.2 原理 利用BOX-PCR指纹图谱比较，检测接种根瘤菌菌株的占瘤率，评价供试菌株相对于土著根瘤菌的竞争结瘤能力；根据根瘤固氮酶活性和大豆植株全氮含量，协同评价根瘤菌的固氮能力。 4.3 主要材料与用具 铁锹、小铲、镊子、记号笔、塑料袋、剪刀、冰盒、小型离心机、微量可调移液器及对应的无菌Tip头、1.5mL无菌离心管、振荡培养箱（摇床）、静置培养箱、高压蒸汽灭菌锅、分光光度计、细菌基因组DNA提取试剂盒、超净工作台、PCR仪、电泳仪及电泳槽、凝胶成像分析仪等。 4.4 占瘤率测定方法 4.4.1 蛭石盆栽实验中根瘤菌占瘤率的测定： - 大豆种子的处理：精选无病、饱满的大豆种子，经过酒精、次氯酸钠和无菌水处理后，置于培养基上培养，待其萌芽后，种植于灭菌的蛭石中，进行蛭石盆栽培养。 - 根瘤菌接种：根瘤菌接种于YMA培养基上，培养5天后用生理盐水洗菌液，并在大豆真叶展开时接种。 - 收获根瘤：蛭石盆栽培养45天后，收获根瘤，进行消毒和离心处理，获得类菌体。 - 类菌体DNA制备：采用无菌水悬浮类菌体，煮沸处理后，提取基因组DNA。 - BOX-PCR扩增：进行DNA的BOX-PCR扩增反应，并通过电泳检测产物。 4.5 BOX-PCR产物的检测： 电泳结束后，在凝胶成像分析仪中对凝胶进行成像，检测指纹图谱。