ICS 65.120 B46 DB37 山东省地方标准 DB37/T 3420—2018 混合型饲料添加剂中雌二醇的测定 高效液相色谱法 Determination of estradiol in mixed feed additives High performance liquid chromatography 2018-09-14发布 2018-10-14实施 山东省质量技术监督局 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东省饲料质量检验所。 本标准主要起草人：孙延军、张芸、张玮、门晓冬、李俊玲。 1 范围 本标准规定了混合型饲料添加剂中雌二醇含量的高效液相色谱测定方法。 本标准适用于不含无机载体的混合型饲料添加剂中雌二醇的测定，载体包括稻壳粉、玉米皮、葡萄糖、玉米淀粉、玉米芯粉及多种饲料原料混合物（含桔梗、甘草、白术、赤药、知母、茯苓等）。 本标准检出限为0.5 mg/kg，定量限为1.0 mg/kg。 2 规范性引用文件 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 20195 动物饲料试样的制备 3 原理 试样中雌二醇用乙腈提取，经固相萃取柱净化后，采用高效液相色谱仪测定，外标法定量。 4 试剂与材料 所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 4.1 乙腈：色谱纯。 4.2 甲醇：色谱纯。 4.3 雌二醇标准品：CAS号50-28-，含量≥98.5%。 4.4 5%甲醇溶液：取5 mL甲醇用水定容至100 mL。 4.5 乙腈水溶液：乙腈+水=4+6（V/V）。 4.6 雌二醇标准贮备溶液：称取标准品0.1 g（精确至0.0001 g）于10 mL容量瓶，用甲醇定容至1 mg/mL，2℃～8℃保存，有效期6个月。 4.7 雌二醇标准工作溶液：由贮备液稀释至100 μg/mL，2℃～8℃保存。 4.8 标准系列溶液：配制0.50～20.00 μg/mL系列标准溶液，现用现配。 4.9 固相萃取柱：HLB柱（60 mg/3 mL）或等效柱。 4.10 微孔滤膜：0.22 μm，有机相。 5 仪器设备 5.1 高效液相色谱仪（配DAD或UV检测器）。 5.2 分析天平（0.001 g及0.0001 g）。 5.3 氮吹仪。 5.4 离心机（≥5000 r/min）。 5.5 涡旋振荡器。 5.6 固相萃取装置。 5.7 旋涡混合器。 6 样品制备 按GB/T 20195制备试样，粉碎过0.45 mm筛，混匀后备用。 7 试验步骤 7.1 提取 称取试样2 g（精确至0.001 g），加入20 mL乙腈，涡旋20 min后以≥5000 r/min离心5 min，取上清液5 mL于试管中，50℃氮吹至约2 mL，加4 mL水混匀备用。 7.2 净化 固相萃取柱依次用甲醇和水活化。将提取液上柱，用水及5%甲醇溶液淋洗，抽干后用甲醇洗脱，收集洗脱液，50℃氮吹干。用1 mL乙腈水溶液复溶，过0.22 μm滤膜，得待测液。 7.3 测定 7.3.1 液相色谱条件： 色谱柱C18（150 mm，粒径3.5 μm）或等效柱； 柱温40℃； 检测波长225 nm； 流动相A为乙腈，B为水，梯度洗脱； 流速1.0 mL/min； 进样量20 μL。 （梯度洗脱程序后续内容未完整识别）