YC/T 150-2002 Determination of genetically modified tobacco seeds
Basic Information
Standard ID:
YC/T 150-2002
Standard Name: Determination of genetically modified tobacco seeds
Chinese Name:
烟草种子 转基因的测定
Standard category:Tobacco Industry Standard (YC)
state:in force
Date of Release2002-09-12
Date of Implementation:2002-12-01
standard classification number
Standard ICS number:Agriculture >> 65.160 Tobacco, tobacco products and tobacco industry equipment
Standard Classification Number:Food>>Cigarette Making>>X85 Cigarette Making Comprehensive
associated standards
Publication information
publishing house:China Standards Press
ISBN:155066.2-14895
Publication date:2004-04-24
other information
drafter:Jiao Qingming, Guo Zhaokui, Gui Xinfu, Wan Xiuqing, Yu Yanhua, Wei Jicheng
Drafting unit:China Tobacco Northeast Agricultural Experiment Station
Focal point unit:National Tobacco Standardization Technical Committee
Proposing unit:Agricultural Technical Committee of the National Tobacco Standardization Committee
Publishing department:State Tobacco Monopoly Administration
Introduction to standards:
This standard specifies the determination method of genetically modified tobacco seeds. This standard applies to tobacco seeds. YC/T 150-2002 Determination of genetically modified tobacco seeds YC/T150-2002 Standard download decompression password: www.bzxz.net
Some standard content:
ICS 65.160
备案号：10587—2002
中华人民共和国烟草行业标准
YC/T150—2002
烟草种子
转基因的测定
Tobacco seed----Determination of genetically modified organism2002-09-12发布
国家烟草专卖局发布bzxZ.net
2002-12-01实施
YC/T150—-2002
本标准由全国烟草标准化委员会农业分技术委员会提出。本标准由全国烟草标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国烟草东北农业试验站。本标准主要起草人：焦庆明、郭兆奎、闫新甫、万秀清、于艳华、魏继承。658
1范围
烟草种子
本标准规定了烟草种子转基因的测定方法。本标准适用于烟草种子。
2引用标准
转基因的测定
YC/T150—2002
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。YC/T149-2002烟草及烟草制品转基因的測定3术语
应符合YC/T149—2002第2章的规定。4实验室要求
应符合YC/T1492002第3章的要求。5试剂
应符合YC/T1492002第4章的要求。6仪器与耗材
应符合YC/T149—2002第5章的要求。7样品的取样方法
以品种为单位，即每个品种作为一个样品，对虽为冏一品种，但种子产地或种子生产年份不同，也作为单一样品取样，每一样品随机多点取样10g，样品编号注明品种名称、种子产地和生产年份。8DNA 提取
8.1前处理
随机取烟草种子0.5g放入装有滤纸保湿的培养Ⅲ中，28℃光照下培养5d，种子萌发出苗后，用滤纸吸出表面水分。
8.2DNA提取
8.2.1种子萌发后提取
8.2.1.1种子萌发幼苗称量约300mg，在灭菌的研钵内加液氮研磨呈粉未，装入1.5ml.离心管中。8.2.1.2取300mg液氮研磨后的粉末，加人200μL2×CTAB提取缓冲液，充分混勾后，65C水浴10 min。
8.2.1.3加人等体积的三氟甲烷：异戊醇（24：1），混合均匀12000r/min离心4min。659
YC/T 150—2002
8.2.1.4取上清液，加1/10体积的10%CTAB提取缓冲液，加人等体积的三氯甲烷：异戊醇（24：1),混合均匀后12000g离心4min。8.2.1.5取上清，加等体积的CTAB沉淀缓冲液，混匀15000r/min离心8min。8.2.1.6去上清，沉淀加100μL高盐TE缓冲液，65℃水浴10min。8.2.1.7加人二倍体积冷无水乙醇，于一40℃下30min。8.2.1.815000g离心8min，沉淀溶于70uL超纯水中。8.2.2种子未经萌发直接提取
8.2.2.1将烟草种子浸泡于无菌水中过夜或放入65C水中1h，取100mg膨涨的种子放人2mL离心管中捣碎，加入500μl.1XCTAB抽提缓冲液，剧烈振荡混合均匀后放入65C的恒温水浴中30min。再12 000 g离心10 min。
8.2.2.2取上清液，加200μL三氯甲烷混合均匀，12000r/min离心10min。8.2.2.3取上清液，加2倍体积的CTAB沉淀缓冲液，室温下1h，12000g离心5min。8.2.2.4去上清液，沉淀加入350μL高盐TE缓冲液，加350uL.三氯甲烷混合30s，离心10min。8.2.2.5取上清液，加0.6倍体积异戊醇12000r/min离心10min。8.2.2.6去上清液，沉淀加人500μL乙醇轻微振荡并混合均匀，15000r/min离心10min，沉淀溶于50μl超纯水中。
8.3DNA含量和纯度的测定
应符合YC/T149--2002第7.3条的规定。9PCR检测
应符合YC/T149--2002第8章的规定。10烟草种子的卡那素抗性法测定10.1把每份种子样品分别放人1.5mL的离心管中。10.2管内加1.0mI.70%的无水乙醇，然后立即用灭菌的移液器将无水乙醇吸出。10.3管内加人1.0mL次氯酸钠，保持30min，期间正反混合均匀几次，然后将液体用移液器吸出。10.4用灭菌水清洗四次。
10.5取-个1mI的枪头，将枪头剪开，使种子能从离心管中吸出，移到1/2MS培养基上光照培养。10.6将萌发的种子转移到分别含有质量分数为0μg/g、50μg/g、100μg/g卡那霉素的1/2MS培养基上生长，14d以后，以同品种的转基因阳性和阴性材料为对照，观察待测样品种子萌发及其生长情况，质量分数为100ug/g卡那霉素培养中烟苗颜色变黄，即为非转基因烟草：颜色仍为绿色，是转基因烟草材料。
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