DB43/T548-2010 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测方法 发布单位：湖南省质量技术监督局 发布日期：2010-02-25 实施日期：2010-03-31 前言 本标准规定了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的RT-PCR检测方法，包括实验室病料采集、RNA提取、RT-PCR操作程序以及结果判定。本标准适用于湖南省相关实验室和疾病监测机构。 1 范围 本标准适用于高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测，涵盖病猪组织样品和血液样品的采集、处理、RNA提取及RT-PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本标准的应用是必不可少的，引用文件中注明日期的版本适用，未注明日期的使用最新版本，包括所有修改单。相关参考文件包括GB/T32、M/T7730等。 3 术语和定义 3.1 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly Pathogenic PRRSV）：指能够引起猪高发病率和死亡率，尤其表现为繁殖障碍和呼吸系统综合症的病毒株。 5 试剂材料 5.1 常规试剂：实验室常规分子生物学试剂及设备。 5.2 RNA提取试剂：可使用Total RNA Extraction Kit进行样品RNA提取。 5.3 RT-PCR试剂：可使用Access RT-PCR Kit进行反转录和扩增。 5.4 引物： 上游PRHSY-b-UP：5'-CTAGAACTGTGACAACAAC-3' 下游PRASV-dE：5'-TGAGTALTTIGGGCGIGICAT-3' 产物长度约252 bp。 6 操作程序 6.1 样品采集与处理：采集非免疫高致病性猪PRRSV感染病猪的肺、脑、血液等新鲜病料。剪取病变与健康组织结合部约0.5 g置研磨器研磨，加入1.0 mL PBS缓冲液研磨。 6.2 RNA提取：按试剂盒说明进行RNA提取，提取后RNA在-20℃保存。 6.3 RT-PCR反应体系：25 μL体系，包括5×Buffer 5 μL，MgSO4 1 μL，dNTP 5 μL，上下游引物各20 pM，反转录酶0.5 μL，模板RNA 5 μL。反应条件：45℃ 45 min，94℃ 2 min；35个扩增循环：94℃ 30 s，55℃ 45 s，68℃ 45 s，最终68℃延伸 2 min，4℃保存。 6.4 电泳检测：取8 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，判定结果见NY/T772-2007标准。 7 结果判定 7.1 阳性对照应出现约252 bp扩增带，阴性对照无扩增带。 7.2 样品出现约252 bp扩增片段判定为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸阳性，否则判定为阴性。