SN/T 2022-2007 牛温氏附红细胞体聚合酶链式反应操作规程 SN/T2022-2007 标准下载解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2022—2007
牛温氏附红细胞体聚合酶链式反应操作规程
Protocol of polymerase chain reaction (PCR) forEperythrozoonwenyoni
2007-12-24发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2008-07-01实施
本标准的附录A为规范性附录。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、华中农业大学。-iiKAoNiKAca
SN/T2022—2007
本标准主要起草人：季树清、胡永强、赵俊龙、王巧全、陈志飞、杜凯、王贵强、刘焕章本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准I
1范围
牛温氏附红细胞体聚合酶链式反应操作规程
本标准规定了温氏附红细胞体聚合酶链式反应方法本标准适用于温氏附红细胞体的鉴定和检测2概述
SN/T2022—2007
温氏附红细胞体（Eperythrozoonwenyoni，E.enyoni）是附着于牛的红细胞或游离于胞浆的一种立克次氏体，可通过吸血昆虫、螨虫、母体胎盘、血液等传播。牛感染E.wenyoni一般不表现临床症状，严重感染引起发热、消瘦和黄痘，本标准根据E.wenyoni16SrRNA的保守序列，设计了一对特异引物mwF/mwR3，通过PCR反应可扩增出738bp的片段，用于温氏附红细胞体的鉴定和检测3设备和材料
3.1仪器设备
3.1.1PCR扩增仪，
3.1.2电泳仪。
3.1.3凝胶成像系统。
3.1.4微波炉。
3.1.5可调移液器（2μ，10μL，100μL.200μ，1000）。3.1.6
离心机。
天平（0.0001g）。
3.1.8水浴锅。
3.2耗材
3.2.1PCR反应管。
3.2.21.5mL离心管。
3.2.3移液器滴头。
3.3试剂
3.3.1三蒸水0.103MPa灭菌15min。3.3.2琼脂糖。
3.3.3溴化乙锭。
3.3.4Taq酶(5U/μL)。
3.3.510XPCR反应缓冲液
3.3.6氯化镁（MgCl）25mmol/L。3.3.71mmol/LdNTP。
3.3.8苯酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1)。3.3.9分子量指示物：100bp~2000bpDNAMarker。050mg/mL溶菌酶、10%SDS、10mg/mL蛋白酶K，5mol/L氯化钠（NaCI）、5%十六烷基三甲3.3.10
基溴化铵（CTAB）、2mol/L乙酸钠（NaAc）、70%乙醇、10mg/mL溴化乙锭（EB）、Tris-乙酸电泳缓冲1
SN/T2022—2007
TYKANIKAca
液（TAE）、1.5%琼脂糖凝胶、6X加样缓冲液、3.8%柠檬酸钠、1.5%乙二胺四乙酸二钠（EDTA二钠）的配制见附录A。除另有规定，所用化学试剂均为分析纯。3.4引物
引物序列见表1。引物用灭菌三蒸水配成100umol/L母液，一20℃冻存。使用时用灭菌三蒸水配成5umol/L的工作液。
表1试验所用引物序列
核苷酸序列
5-gtaatacatattaacttactttacg-35-agcactcgactagatgte-3
a上游引物forwardprimer。
b下游引物 reverse primer。
操作步骤
4.1样品采集
引物浓度/（μmol/L）
引物位置
106-132.27bp
（AY946266)
826-843.18bp
(AY946266)
无菌采牛血，用3.8%柠檬酸钠或1.5%EDTA二钠抗凝作为临床检测样品。4.2样品处理
产物大小/bp
400L抗凝血加10L溶菌酶（50mg/mL）涡旋混匀，37℃下温育1h：加入70μL10%SDS，6l蛋白酶K（10mg/mL），65℃下温育10min；加入100μL5mol/L氯化钠，160μLCTAB，65℃下温育10min；加入等体积的苯酚-三氯甲烷-异戊醇抽提，常温下12000×g离心10min；取上清液，再次加入等体积的苯酚-三氯甲烷-异戊醇抽提，常温下12000Xg离心10min；取上清液，加人两倍体积的无水乙醇和1/10体积的2mol/L的乙酸钠，一20℃沉淀30min，13000×g4℃离心10min；弃上清液，沉淀用冷70%乙醇洗一次，自然干燥；用20uL的三蒸水溶解，一20℃保存备用4.3PCR
4.3.1对照设立
阳性对照用E.wenyoni16SrRNA部分序列连接在PMD18-T载体上构建的重组质粒；阴性对照用健康牛抗凝血提取的DNA作为对照；空白对照用灭菌三蒸水。
4.3.2PCR反应体系
总体积30μL，10XPCR反应缓冲液3μL：氯化镁（MgCl，）3μL：dNTP3μL；引物mwF和mwR3各1μL；阳性对照（10ng～20ngDNA）或样品1uL；0.2μLTaqDNA聚合酶，18μL三蒸水。4.3.3循环参数
PCR反应循环参数为94℃3min；94℃30s.50℃30s.72℃1min，35个循环；最后72℃3min。4.3.4电泳
取PCR产物10μL与2μL6×加样缓冲液混合，加样于含EB的1.5%琼脂糖凝胶中。在1×TAE缓冲液中，3V/cm~4V/cm电泳约30min，当溴酚蓝到达底部时停止电泳，用凝胶成像系统分析。
阳性、阴性、空白对照和DNA分子量指示物同样电泳。2
结果判定
5.1对照
阳性对照出现738bp的DNA片段；阴性和空白对照不出现任何DNA片段；一对照成立才能进行判定。
5.2样品判定
样品经PCR扩增后：
无核酸带或带的大小不在738bpDNA位置上判为温氏附红细胞体阴性；在738bpDNA位置上有核酸带，判为温氏附红细胞体阳性；SN/T2022—2007
一阳性样品进行测序，将序列与Genbank中温氏附红细胞体16SrRNA序列进行比较确诊。3
SN/T2022—2007
A.150mg/mL溶菌酶
溶菌酶
附录A
（规范性附录）
试剂配制
加三蒸水至1mL，溶解分装后，一20℃保存备用。210%+二烷基硫酸钠（SDS)的配制A.2
加三蒸水
68℃加热助溶，用浓盐酸调pH至7.2，三蒸水定容至100mL。A.310mg/mL蛋白酶K的配制
蛋白酶K
加三蒸水
溶解分装后，一20℃保存备用。A,45mol/L氯化钠（NaCI)的配制氯化钠(NaCI）
加三蒸水
加热，搅拌溶解后定容至100mL，0.103MPa灭菌15min备用。A.5
5%CTAB的配制
氯化钠（NaCI）
-TKANiKAca
用三蒸水80mI.溶解NaCl.缓慢加人CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），同时加热并搅拌，溶解后定容至100mL。
2mol/L乙酸钠（NaAc）
乙酸钠（NaAc·3H,O)272g
加三蒸水定容至1000mL，用3mol/L乙酸调pH至5.2。A.770%乙醇下载标准就来标准下载网
无水乙醇
加三蒸水定容至100mL，混匀4℃备用。A.810mg/mL溴化乙锭（EB）的配制1g
加三蒸水定容至100mL，磁力搅拌至完全溶解，室温避光保存。4
9Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE）的配制A.9
A.9.10.5mol/LpH8.0乙二胺四乙酸二钠（EDTA二钠）的配制EDTA二钠
三蒸水
SN/T2022—2007
磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠（NaOH)调节pH至8.0（约20g氢氧化钠颗粒），加三蒸水定容至1000mL。0.103MPa灭菌15min备用。A.9.250×TAE的配制
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris碱）冰乙酸
0.5mol/LEDTA(pH8.0)
加三蒸水定容至1000mL，混匀4℃保存备用。临用前作50倍稀释。A,9.31×TAE使用液的配制
50XTAE
加三蒸水定容至1000mL混匀备用1.5%琼脂糖凝胶的配制
琼脂糖
加1XTAE定容至100mL，完全融化后，溶液冷却至60℃，加10mg/mLEB5uL（终浓度0.5ug/mL），轻轻混匀后，倒板。6×加样缓冲液的配制
溴酚蓝
加三蒸水
至100ml
混匀，置4℃保存备用。
23.8%柠檬酸钠（柠檬酸三钠）的配制A.12
柠檬酸钠
加三蒸水
至100mL
混匀，0.07MPa灭菌15min备用。使用时与血的比例为1：10。A.131.5%乙二胺四乙酸二钠（EDTA二钠）的配制EDTA二钠
加三蒸水
至100mL
混匀，分装0.4mL/瓶，100℃烘干后可抗凝5mL血液，5
SN/T 2022-2007
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
-TKANiKAca
牛温氏附红细胞体聚合酶链式反应操作规程
SN/T2022—2007
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880X1230
2008年3月第一版
印张0.75
字数10千字
2008年3月第一次印刷
印数1—2000
书号：155066·2-18496
定价8.00元
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。