SN/T 1905-2007
基本信息
标准号： SN/T 1905-2007
中文名称：牛病毒性腹泻/粘膜病反转录聚合酶链反应操作规程
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
发布日期：2007-05-23
实施日期：2007-12-01
出版语种：简体中文
下载格式：.rar.pdf
下载大小：231227
标准分类号
标准ICS号：医药卫生技术>>11.220兽医学
中标分类号：农业、林业>>畜牧>>B41动物检疫、兽医与疫病防治
关联标准
出版信息
页数：10
标准价格：8.0 元
相关单位信息
起草单位：国家认证认可监督管理委员会
标准简介
SN/T 1905-2007 牛病毒性腹泻/粘膜病反转录聚合酶链反应操作规程 SN/T1905-2007 标准下载解压密码：www.bzxz.net
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1905—2007
牛病毒性腹泻/粘膜病反转录聚合酶链反应操作规程，
Protocol of reverse transcription polymnerase chain reactionfor bovinc yiral diarrhca/mucosal discasc2007-05-23发布
华人民！和国
国家质量监督检验检疫总
2007-12-01实施
本标准的附求A为舰范性附求.随录为资料性求，本标准由医家认证认可监督管理委员会提出并力口：KAONKAca-
SN/T1905—2007
本标滩起草单位：中华人民共和国占林出入境检验恰疫局深圳市匹基生物工程股份有限公司，本称滩主要起草人：正伟利、1振国、刘企华、孟月增、肖戒蕊、石建平、牟峻、逢奎春、杨伟、少悔本标准系首次发布的检验检疫行业标准，1范围
牛病毒性腹泻/粘膜病反转录聚合酶链反应操作规程
不标滩规定了牛病市性腹泻/粘膜病病萨反转录象合链式反成检测方汰。本标适压牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的检测2 规范性引用文件
SN/T 1905—2007
列实件的条款通过本述准的引用成为会标谁的条款：凡屁注比期的引用义件：其随后所台的修改单（不包拆勘误的内容)或修订版哟不适出于本标准，然而，鼓励根拆本标准达成协议的各方评究是否可使用这些文作的新版本，凡足不期的引用文件，其最新版个适而下本标（G13/16G82分析实验案用水规格和试验方法3原理
根据牛病市性泻/粘膜病病再基因红5端非编码区最保守的核作峻序列,设汁合贼一对特异性引物.利而反转录聚合酶链式反应技术分引采而一少法利两少法从各种样品中扩增牛病素性腹污/粘膜病病柄霉物特异性片段，该片段既可用丁病荐性泻/粒脱病病旁必因分型支可以区别于他癌舜属成员
4设备和试剂
4.1主要仪器和设备
4.1.1PCR扩增仪。
4. 1.2低温高速心机、微量高速离心机。4.1.3电漆仪、电泳遭
4.1.4凝胶成像分析系统。
4.1.5冰箱，
4. 1. 6 超净工作台
4.1.7纽织匀浆器。
二氧化谈培养箱。
4.2试剂和耗材
4.2.1水：所用水应符合（13/1 G682序—级水（一然水)的规格。用丁P(R(心其核骏提收)的水要用LEIC处理以除掉RA酶,配制方法见篇A，14.2.2营养液：配制方汰州第 A.2章4.2.3持液：配制方法见第A.3章4.2.4细胞分激液：配制方法见第A.4章4.2.5花学试剂：所有临化学试剂均为分析纯。（a1rimox-14（Crt-12）、梳氙废胍、药、一氯半烷、存橡酸钠、正「谭、乙钠、乙膜、异丙厚（一20℃颅冷)。4.2.6H他试剂:RT PCR Becs(皮转录) AMV 皮转录薄5 Lml)、Ta INA 聚个5 μL）,dNTPs(种浓度巧为1011ol/L）,RNsin(49U/μL)，MgCl（1511ol/L)球脂糖（电泳级）SN/T 1905—2097
DXA Marker D1.2000-
4.2. 70×Tris-冰乙酸(TAF)中泳缓冲液;配制方法见第 A.：章4.2.810m/ml.澳化乙锭溶液:配制方法见第A.6章，4. 2. 9 15娠脂糖凝胶:配制方法见第 1. 7 章TYKAONTKAca
4.2.15引物：根洋病卡性满/粘膜病病尚(BV1V)国际标准株基幽序列,在H最保守的5端非编码区 序 列 设 合 成一刘对特所 性 引物:5AGTAGHXAIGTTAGT R :IGAGHA(CCTATCAGG3°制成 20 mol/L20C保存4.2. 11 可凋微量移液器(20 μL--1 0c0 μL,2C μL-~2C0 μL,2 μL-~20 μL,0. 5 μL-~10 μL),4.2.121.5 mI..0.2mI.离心管利吸头(而DEPC 水处坦后高压灭菌备月,处理方法见第A.8章）4.3标准毒株和细胞
4.3.1弥泄葬侏以可你标雅每味人A的侏或（:1株为试的参照毒株。4.3.2细胞:按滑规方法最得康新生牛些丸 判备原代率丸细炮、5阳性对照样品和阴性对照样品
5.1阳性对照样品
山击定单位握供或接下列方法制备：将牛病带性腹泻糕膜病国际标准带株按10少接种原代學丸纠地：于37吸阴】h后加人维托液37培准，CFF达到70为时牧状病荧恩液：冻融2次·3次，33c0r/min离心10 n-in，取上清液备王：
5.2阴性对照样品bzxz.net
由指定单位提供或接下列方法制备：将三长良好的原代罩划细脂.陈熟2次~-3次，5 coc r/min离心10 in.「清液备用。6试验方法
6.1样品的处理
6.1.1组织样品:他拆从畅粘膜刮收的物质,肾、肝，肺,淋巴结脾胸腺。娘28-~5组织样品切成小块-灿5 mL～15 mL预冷的Iaks 衡盐淬液匀浆2rmnin，判&液,4℃ 50co /mit离心_0 ir取150μl.清液加人1n（all14振荡混匀，6.1.2液体样品:包括血清、血滋（加扩檬酸盐,11)1A，肝素等）各种拭了（异格、管和眼），精液。6. 1.2. 1含 E[A的血液：收5I.抑到装有1 rmI.1×SS见第A. S 章)溶液的离心管中,混勾;1'C12 00 t/mit:,离心「irin,倒掉「清液,将沉淀物重部悬浮」残荫液中,川入 ic0 μ.Cr1-[4振离混6. 1.2.2含柠樣较辆或肝素的血液:取 5 uT.加入5cO ul. Cal 14摄荡混约6.1.2,3而消，粘液、条种试了感液等液体样品：取二0℃rL.加人500 uL Ca:14菊混匀6.1.3阴性和用件对照样品：分别或100l,加人500u1.（114振荡视匀6. 2RV 的提取
上述各种处理样品立即振荡30s，室温效置0min-30min样品1（:2000/ri：离心5min，倒于吸水纸·活干液体，辫时离心55开带恶的吸头吸干裁留液怀将玩淀溶于200LGII℃（见第A.10 章)缓冲液卫.间歌娠荡5 tmin,置」冰.l..上述感浮液斥100μ1.水饱和酚和100μ1.预冷的含2※正丁醇的三氯巾烷行抽提：振荡305.112 000 r/mir,离心min;瑕上消液：加入190μul.预冷（20)的含 2止丁醇的一氯甲烷振荡30 s2：12000+/mit:离心mim收[清液「清液加人30℃.另丙孵，一73℃冻存0.5h.或者一20%.少「h避夜或更长时问）最出后120901/nn.离心5 rmn，月09L80%艺等漂洗，可用09uL100%题冷一292
SN/T 1905—2007
的乙漂洗。真空焕，牵下圳人I.1EP水，落解管壁上的RNA，轻轻混勾，200/min离心5：冰「保存备压，若放置一73℃可长期保存6. 3 PCR 扩增
6.3.1检测万法1：一少法（固反转录酶：6. 3. 1.1反应体系25 L:取出 1a4 1)>A 聚个酶、RT PCRBeads(百体醇颗粒).引物1,引物2 和制备的RVA，在已编好号的.2m.的PCR反应管中，按表「逊行反成液的配比，混勾压瞬离。表1
RT-PCR Heads
引物:2: μmol/L)
引物 2:20 μmol/L)
T INA 聚合谢(5 LL)
0.2s μrL
6.3.1.2扩增程序及反应条件:12℃ 3G rnin:92℃ 3 rmin:92℃ 15 s.58℃ 3G s.72℃ 1 rmin10 个循坏;72℃10 min;坂后2℃保温
6.3.2检测方法2：步法（液木反转录）6. 3. 2. 1 反成'本系 25 μl.,5× 13uffe: 5 μI.,aNTP( 2. E mmol/I.)2 μl.,Mg.-, (15 mmol/1.)2. 5 μrl.AMV反转录( U/μL)2 Ta ( U/μI).12 [上游引物和下游物(20 Hmol/1.)G. 5 μl、RVA 1 μL.ddll.O &. 375 μ,滤多后虑离-6.3.2.2广增程序及反应条件;42 3C nin;95. 3 min;90T 30 5.58℃ 15 s,72 30 5:35 个循环72 1 min最后 保流
6.3.3恰测法3：步法（渡外反转录酶）6. 3. 3. 1 RT(反转录):反应体系 20 uL:AMV RT 5X Bulfer 2 L,eVTP(2. 5 mncl/L)2. 5 tL,RV-sir(0/l)μ反转录姆((/μI)1μ[,上游引物或下游场(20 μmol/1) μI,模板RNA[cdH:O5.5ml.混句后瞬离
6.3.3.2广增程序及反应条件：12℃水浴69 min,99C热沸5mim。6. 3. 3. 3PCR 护增:反成体系为 25 μT.: 模板 T)NA 1 μJ Ta 酶(5 U/μI.) C. 2 μ、VTT(2. mmol/1)1 μl,上学物和下游物(20 μnol/1)各 0. E μI.,10x Ruffer(含 Mg21 32. 5 μl.,ddH,(19.37#1混约后降离。
6. 3. 3.4 广增程序及反应条件:94℃ 5 mi1;94℃ 3G 5:52℃ 10 s;72℃ 1 =min.35 个循坏;72C 5 rmir1;最后4℃保湿，
7PCR产物的电泳检测
用TAE电泳缓冲液（见附录A)配制成1%琼脂糖平极（溴化乙键终浓度0.E/r1)，将平极放人水平电泳糖中，加人TAE电泳缓冲液至刚冠高出凝胶表将CR扩增物6μ[.与6μI上样缓冲液混合，分剂人样品礼中,取：>AM:krrL200灿人到标谁分子量对照礼内。V/恒压电泳 30 min~-45 rnin-
8结果判定
8.1用胶成像系统进行分析，
SV/T 1905—2097
rYKAoNi KAca
阿唑样品条带，陷性样品不条带，大小为2hp，在阿唑和阳性对照成立情况下，如被检样品无条带，则结果为阳性，始被检样品有条带，大小与所性样品相同为244hp，即可判定为阳性。必要府取PCR拉增产物进行测序，如缩果与附录B参考序列比较,序列析似性在5关以1，可进-步确认待测群品综果为性：
如采凹现与设计长度不同的条带-为特性度应·需复试验，两次试验为非特另性反应时，8.3
川州为阴性
附录A
（规范性附录）
水、细胞培养液及试剂配置
A，1DEPC-ddTIO焦碳酸二乙酯（DEPC)处理的双蒸水SN/T 1905—2007
19c0 mI双蒸留水加 1 mI.EP,空温放置 2h 以上,0.1C5 MPa蒸次高乐 80 min，i或牢湿保存：
A.2营养液
DMEM培差基加10为无BVI)抗沐牛血清，内含青需索20CIU/=nL.链带素200I/m，滤除菌
A.3维持液
1MEM培养扇内个寺毒素200JT:/mT.，链毒慕200IT:/mT.拍滤徐卤，A.4细胞分散液
乙胺四Z酸钠（DTA)
光钙镁P13S
抽滤除菌,1℃保存备用。
A.550 ×Tris-冰乙酸(TAE)电泳缓冲液Tris
淼乙酸
0, 5 mol/I EDTA(p18. 0)
一熊水定容至
高压灭菌，备用。
A. 610 mg/mL溴化乙锭溶液
三然水
浪化锭
I os ml
暨棕色瓶中力搅拌数小时以确保其会溶解，然后用铝箔包裹容器保丁室温A.71%琼脂糖凝胶的配制
源脂糖
TAE电泳缓冲液(52倍）
灭园三蒸水
微波炉中完全融花，加溴化乙锭(E)液5=L.。A.8离心管、吸头处理方法
高心管吸头应改在3.1LEI℃水没泡h以「:,取出烘干EIC水后再C.105MPa蒸汽高SN/T 1905—2097
床 30 mim,惊1片使用。
A.91×SsC溶液
0,15ml/L氯化纳(NaCl)、5 mIl/L柠蒙较、a17.A.10
GITC:缓冲液
4 mol/1.异硫台酸肌,0. 2 r1o1/1. 乙酸纳(pH1),0. 1 r:10./1. 2-统本乙醇6
TYKAONTKAca
附录Ｒ
（资料性附录）
BVIV扩增产物的序列
SN/T 1905—2007
AGGCIAGCGA TGGCT'TAGT AGGAGTAGCA TAAIGAGGGG GGTAGGAACAGTGGTGAGTT
S1--12QCGTTGGATGG CTTAAGCCCT GAGTACAGGG TAGTCGTCAG TGGTTCGACGCCTTGGAATA
12I-- :8G AAGGTCTCGA GATGCCACGT GGACGAGGGC ATGCCCAAAG CAGATCTTAAGTGAGGGGG
IRI-Z4O GGTCGCCCAG GTAAAAGCAG TTTTAAXGA GTGTTACGAA TACAGCCTGATAGGGTGCT.
211--242 CAGA
SN/T1905-200/
TTKAONTKAca-
中华人天共和人境签验检疫
行业标准
牛病毒性腹泻/粘膜病反转录聚合酶链反应操作规程
SN/T 10C5-2007
中日标准山版社出版
北东兴门外三年河北街1S5
服政编好：13005
网 spc. ne1, cn
电话：685233-668517518
中国准巴版在秦皇岛印刷广印刷川小580×133℃1/16前张0.75
：学数12千学
2907年9月第版2007年9月第“次印划印数2(
马号：10=066-2-18319宗价8.00元2002—G061 L/NS
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牛病毒性腹泻/粘膜病反转录聚合酶链反应操作规程，
Protocol of reverse transcription polymnerase chain reactionfor bovinc yiral diarrhca/mucosal discasc2007-05-23发布
华人民！和国
国家质量监督检验检疫总
2007-12-01实施
本标准的附求A为舰范性附求.随录为资料性求，本标准由医家认证认可监督管理委员会提出并力口：KAONKAca-
SN/T1905—2007
本标滩起草单位：中华人民共和国占林出入境检验恰疫局深圳市匹基生物工程股份有限公司，本称滩主要起草人：正伟利、1振国、刘企华、孟月增、肖戒蕊、石建平、牟峻、逢奎春、杨伟、少悔本标准系首次发布的检验检疫行业标准，1范围
牛病毒性腹泻/粘膜病反转录聚合酶链反应操作规程
不标滩规定了牛病市性腹泻/粘膜病病萨反转录象合链式反成检测方汰。本标适压牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的检测2 规范性引用文件
SN/T 1905—2007
列实件的条款通过本述准的引用成为会标谁的条款：凡屁注比期的引用义件：其随后所台的修改单（不包拆勘误的内容)或修订版哟不适出于本标准，然而，鼓励根拆本标准达成协议的各方评究是否可使用这些文作的新版本，凡足不期的引用文件，其最新版个适而下本标（G13/16G82分析实验案用水规格和试验方法3原理
根据牛病市性泻/粘膜病病再基因红5端非编码区最保守的核作峻序列,设汁合贼一对特异性引物.利而反转录聚合酶链式反应技术分引采而一少法利两少法从各种样品中扩增牛病素性腹污/粘膜病病柄霉物特异性片段，该片段既可用丁病荐性泻/粒脱病病旁必因分型支可以区别于他癌舜属成员
4设备和试剂
4.1主要仪器和设备
4.1.1PCR扩增仪。
4. 1.2低温高速心机、微量高速离心机。4.1.3电漆仪、电泳遭
4.1.4凝胶成像分析系统。
4.1.5冰箱，
4. 1. 6 超净工作台
4.1.7纽织匀浆器。
二氧化谈培养箱。
4.2试剂和耗材
4.2.1水：所用水应符合（13/1 G682序—级水（一然水)的规格。用丁P(R(心其核骏提收)的水要用LEIC处理以除掉RA酶,配制方法见篇A，14.2.2营养液：配制方汰州第 A.2章4.2.3持液：配制方法见第A.3章4.2.4细胞分激液：配制方法见第A.4章4.2.5花学试剂：所有临化学试剂均为分析纯。（a1rimox-14（Crt-12）、梳氙废胍、药、一氯半烷、存橡酸钠、正「谭、乙钠、乙膜、异丙厚（一20℃颅冷)。4.2.6H他试剂:RT PCR Becs(皮转录) AMV 皮转录薄5 Lml)、Ta INA 聚个5 μL）,dNTPs(种浓度巧为1011ol/L）,RNsin(49U/μL)，MgCl（1511ol/L)球脂糖（电泳级）SN/T 1905—2097
DXA Marker D1.2000-
4.2. 70×Tris-冰乙酸(TAF)中泳缓冲液;配制方法见第 A.：章4.2.810m/ml.澳化乙锭溶液:配制方法见第A.6章，4. 2. 9 15娠脂糖凝胶:配制方法见第 1. 7 章TYKAONTKAca
4.2.15引物：根洋病卡性满/粘膜病病尚(BV1V)国际标准株基幽序列,在H最保守的5端非编码区 序 列 设 合 成一刘对特所 性 引物:5AGTAGHXAIGTTAGT R :IGAGHA(CCTATCAGG3°制成 20 mol/L20C保存4.2. 11 可凋微量移液器(20 μL--1 0c0 μL,2C μL-~2C0 μL,2 μL-~20 μL,0. 5 μL-~10 μL),4.2.121.5 mI..0.2mI.离心管利吸头(而DEPC 水处坦后高压灭菌备月,处理方法见第A.8章）4.3标准毒株和细胞
4.3.1弥泄葬侏以可你标雅每味人A的侏或（:1株为试的参照毒株。4.3.2细胞:按滑规方法最得康新生牛些丸 判备原代率丸细炮、5阳性对照样品和阴性对照样品
5.1阳性对照样品
山击定单位握供或接下列方法制备：将牛病带性腹泻糕膜病国际标准带株按10少接种原代學丸纠地：于37吸阴】h后加人维托液37培准，CFF达到70为时牧状病荧恩液：冻融2次·3次，33c0r/min离心10 n-in，取上清液备王：
5.2阴性对照样品bzxz.net
由指定单位提供或接下列方法制备：将三长良好的原代罩划细脂.陈熟2次~-3次，5 coc r/min离心10 in.「清液备用。6试验方法
6.1样品的处理
6.1.1组织样品:他拆从畅粘膜刮收的物质,肾、肝，肺,淋巴结脾胸腺。娘28-~5组织样品切成小块-灿5 mL～15 mL预冷的Iaks 衡盐淬液匀浆2rmnin，判&液,4℃ 50co /mit离心_0 ir取150μl.清液加人1n（all14振荡混匀，6.1.2液体样品:包括血清、血滋（加扩檬酸盐,11)1A，肝素等）各种拭了（异格、管和眼），精液。6. 1.2. 1含 E[A的血液：收5I.抑到装有1 rmI.1×SS见第A. S 章)溶液的离心管中,混勾;1'C12 00 t/mit:,离心「irin,倒掉「清液,将沉淀物重部悬浮」残荫液中,川入 ic0 μ.Cr1-[4振离混6. 1.2.2含柠樣较辆或肝素的血液:取 5 uT.加入5cO ul. Cal 14摄荡混约6.1.2,3而消，粘液、条种试了感液等液体样品：取二0℃rL.加人500 uL Ca:14菊混匀6.1.3阴性和用件对照样品：分别或100l,加人500u1.（114振荡视匀6. 2RV 的提取
上述各种处理样品立即振荡30s，室温效置0min-30min样品1（:2000/ri：离心5min，倒于吸水纸·活干液体，辫时离心55开带恶的吸头吸干裁留液怀将玩淀溶于200LGII℃（见第A.10 章)缓冲液卫.间歌娠荡5 tmin,置」冰.l..上述感浮液斥100μ1.水饱和酚和100μ1.预冷的含2※正丁醇的三氯巾烷行抽提：振荡305.112 000 r/mir,离心min;瑕上消液：加入190μul.预冷（20)的含 2止丁醇的一氯甲烷振荡30 s2：12000+/mit:离心mim收[清液「清液加人30℃.另丙孵，一73℃冻存0.5h.或者一20%.少「h避夜或更长时问）最出后120901/nn.离心5 rmn，月09L80%艺等漂洗，可用09uL100%题冷一292
SN/T 1905—2007
的乙漂洗。真空焕，牵下圳人I.1EP水，落解管壁上的RNA，轻轻混勾，200/min离心5：冰「保存备压，若放置一73℃可长期保存6. 3 PCR 扩增
6.3.1检测万法1：一少法（固反转录酶：6. 3. 1.1反应体系25 L:取出 1a4 1)>A 聚个酶、RT PCRBeads(百体醇颗粒).引物1,引物2 和制备的RVA，在已编好号的.2m.的PCR反应管中，按表「逊行反成液的配比，混勾压瞬离。表1
RT-PCR Heads
引物:2: μmol/L)
引物 2:20 μmol/L)
T INA 聚合谢(5 LL)
0.2s μrL
6.3.1.2扩增程序及反应条件:12℃ 3G rnin:92℃ 3 rmin:92℃ 15 s.58℃ 3G s.72℃ 1 rmin10 个循坏;72℃10 min;坂后2℃保温
6.3.2检测方法2：步法（液木反转录）6. 3. 2. 1 反成'本系 25 μl.,5× 13uffe: 5 μI.,aNTP( 2. E mmol/I.)2 μl.,Mg.-, (15 mmol/1.)2. 5 μrl.AMV反转录( U/μL)2 Ta ( U/μI).12 [上游引物和下游物(20 Hmol/1.)G. 5 μl、RVA 1 μL.ddll.O &. 375 μ,滤多后虑离-6.3.2.2广增程序及反应条件;42 3C nin;95. 3 min;90T 30 5.58℃ 15 s,72 30 5:35 个循环72 1 min最后 保流
6.3.3恰测法3：步法（渡外反转录酶）6. 3. 3. 1 RT(反转录):反应体系 20 uL:AMV RT 5X Bulfer 2 L,eVTP(2. 5 mncl/L)2. 5 tL,RV-sir(0/l)μ反转录姆((/μI)1μ[,上游引物或下游场(20 μmol/1) μI,模板RNA[cdH:O5.5ml.混句后瞬离
6.3.3.2广增程序及反应条件：12℃水浴69 min,99C热沸5mim。6. 3. 3. 3PCR 护增:反成体系为 25 μT.: 模板 T)NA 1 μJ Ta 酶(5 U/μI.) C. 2 μ、VTT(2. mmol/1)1 μl,上学物和下游物(20 μnol/1)各 0. E μI.,10x Ruffer(含 Mg21 32. 5 μl.,ddH,(19.37#1混约后降离。
6. 3. 3.4 广增程序及反应条件:94℃ 5 mi1;94℃ 3G 5:52℃ 10 s;72℃ 1 =min.35 个循坏;72C 5 rmir1;最后4℃保湿，
7PCR产物的电泳检测
用TAE电泳缓冲液（见附录A)配制成1%琼脂糖平极（溴化乙键终浓度0.E/r1)，将平极放人水平电泳糖中，加人TAE电泳缓冲液至刚冠高出凝胶表将CR扩增物6μ[.与6μI上样缓冲液混合，分剂人样品礼中,取：>AM:krrL200灿人到标谁分子量对照礼内。V/恒压电泳 30 min~-45 rnin-
8结果判定
8.1用胶成像系统进行分析，
SV/T 1905—2097
rYKAoNi KAca
阿唑样品条带，陷性样品不条带，大小为2hp，在阿唑和阳性对照成立情况下，如被检样品无条带，则结果为阳性，始被检样品有条带，大小与所性样品相同为244hp，即可判定为阳性。必要府取PCR拉增产物进行测序，如缩果与附录B参考序列比较,序列析似性在5关以1，可进-步确认待测群品综果为性：
如采凹现与设计长度不同的条带-为特性度应·需复试验，两次试验为非特另性反应时，8.3
川州为阴性
附录A
（规范性附录）
水、细胞培养液及试剂配置
A，1DEPC-ddTIO焦碳酸二乙酯（DEPC)处理的双蒸水SN/T 1905—2007
19c0 mI双蒸留水加 1 mI.EP,空温放置 2h 以上,0.1C5 MPa蒸次高乐 80 min，i或牢湿保存：
A.2营养液
DMEM培差基加10为无BVI)抗沐牛血清，内含青需索20CIU/=nL.链带素200I/m，滤除菌
A.3维持液
1MEM培养扇内个寺毒素200JT:/mT.，链毒慕200IT:/mT.拍滤徐卤，A.4细胞分散液
乙胺四Z酸钠（DTA)
光钙镁P13S
抽滤除菌,1℃保存备用。
A.550 ×Tris-冰乙酸(TAE)电泳缓冲液Tris
淼乙酸
0, 5 mol/I EDTA(p18. 0)
一熊水定容至
高压灭菌，备用。
A. 610 mg/mL溴化乙锭溶液
三然水
浪化锭
I os ml
暨棕色瓶中力搅拌数小时以确保其会溶解，然后用铝箔包裹容器保丁室温A.71%琼脂糖凝胶的配制
源脂糖
TAE电泳缓冲液(52倍）
灭园三蒸水
微波炉中完全融花，加溴化乙锭(E)液5=L.。A.8离心管、吸头处理方法
高心管吸头应改在3.1LEI℃水没泡h以「:,取出烘干EIC水后再C.105MPa蒸汽高SN/T 1905—2097
床 30 mim,惊1片使用。
A.91×SsC溶液
0,15ml/L氯化纳(NaCl)、5 mIl/L柠蒙较、a17.A.10
GITC:缓冲液
4 mol/1.异硫台酸肌,0. 2 r1o1/1. 乙酸纳(pH1),0. 1 r:10./1. 2-统本乙醇6
TYKAONTKAca
附录Ｒ
（资料性附录）
BVIV扩增产物的序列
SN/T 1905—2007
AGGCIAGCGA TGGCT'TAGT AGGAGTAGCA TAAIGAGGGG GGTAGGAACAGTGGTGAGTT
S1--12QCGTTGGATGG CTTAAGCCCT GAGTACAGGG TAGTCGTCAG TGGTTCGACGCCTTGGAATA
12I-- :8G AAGGTCTCGA GATGCCACGT GGACGAGGGC ATGCCCAAAG CAGATCTTAAGTGAGGGGG
IRI-Z4O GGTCGCCCAG GTAAAAGCAG TTTTAAXGA GTGTTACGAA TACAGCCTGATAGGGTGCT.
211--242 CAGA
SN/T1905-200/
TTKAONTKAca-
中华人天共和人境签验检疫
行业标准
牛病毒性腹泻/粘膜病反转录聚合酶链反应操作规程
SN/T 10C5-2007
中日标准山版社出版
北东兴门外三年河北街1S5
服政编好：13005
网 spc. ne1, cn
电话：685233-668517518
中国准巴版在秦皇岛印刷广印刷川小580×133℃1/16前张0.75
：学数12千学
2907年9月第版2007年9月第“次印划印数2(
马号：10=066-2-18319宗价8.00元2002—G061 L/NS
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