SN/T 1874-2007
基本信息
标准号： SN/T 1874-2007
中文名称：猪细小病毒病聚合酶链反应操作规程
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
发布日期：2007-04-06
实施日期：2007-10-16
出版语种：简体中文
下载格式：.rar.pdf
下载大小：198237
标准分类号
标准ICS号：医药卫生技术>>11.220兽医学
中标分类号：农业、林业>>畜牧>>B41动物检疫、兽医与疫病防治
关联标准
出版信息
页数：9
标准价格：8.0 元
相关单位信息
起草单位：国家认证认可监督委员会
标准简介
本标准规定了猪细小病毒病聚合酶链反应操作规程。本标准适用于猪细小病毒的检测。 SN/T 1874-2007 猪细小病毒病聚合酶链反应操作规程 SN/T1874-2007 标准下载解压密码：www.bzxz.net
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1874—2007
猪细小病毒病聚合酶链反应操作规程Protocol of polymerase chain reaction for porcine parvovirus2007-04-06发布
华人民！和国
国家质量监督检验检疫总局
2007-10-16实施
本标准的附求A为舰范性求.际录B为资料性附求，本标准由区家认证认可监督委员会提出并灯口本标滩起草单位：中华人民共和[广西出入境检验恰疫局木称滩主要起草人：盘宝，韦梅良，梦兆飞、é文龙、刘军义。本标准系次发布的出入境检验检疫行业标准SN/T1874—2007
一范围
猪细小病毒病聚合酶链反应操作规程本标准规定广猪圳小病毒病合悔铠反成操作现程，本标准适压一猎细小病母的检测，2规范性引用文件
SN/T 1874—2007
下列文件中的条款通过本标准的引用而或为尽标准的条款，凡是注即的引用文件·其随后所的修收单（不包括误的内容)或修订版均不用丁本标准，然而，鼓慰根据本标准达成协议的各方研究是否可使出这些文件的最新版本。尼是不注口期的引用文件,其最新版玄适用于本标淫，SV/T 1193基因检测实验室技术要求3缩略语
下列统喀谱适用于本标：
Ppy Porcine Parvovirus
珺细小病毒：
PCR Polymerasc Chain Keaction聚合爵链反应，
DNAdeoxyribonucleic acidl
脱氨核糖核酸。
dNTp deoxyribonucleoside triphosphate acid脱氨核皆三磷酸。
dATP deoxyadenosine triphosphoric acidl脱氧腺作一磷酸。
dGTp deoxyguanosine triphosphoric acid聪氧鸟作一磷酸。
dCTP deoxycylidine triphosphate acidl脱氧胞作一磷酸。
dTTP dexythymidine triphosphale acid脱氧作一磷酸。
hpbase pair
碱其对，
SN/T 1874—2097
HlTAHthylcnc rliaininctctraacctic arid乙二胺四乙酸，
SDs Sodiun Dodecyl Sulrale
十二烷装硫酸钢。
TrisTris(hydroxynethylamino)nmethane acetate三羟平基氨基十烷，
Na,-EDTA · 2H,oDisodium cthylcncdiamine tciraacctalc二水乙二胺叫乙酸二钠。
4试验材料
4.1试剂、溶液、缓冲液
所有实验试剂均对分柠纯：除特别说明外，窦验用水对二欧蒸罐求改去离子水，4. 1. 1 1 ro./l. T-is-C. 缓冲液-pH8.0:见第 A. I章0.511o1/LETA,pII8.0:沈第 A.2章4. 1. 2
1 o/I 氯亿钠(VaC1)溶液：见第 A.3章,4. 1. 3
T1V样另裂辩缓汀羧,P17,5:见篇 A,4 章。20g/1.蛋白海K，
饱和酚。
三氯中烧：
只设辟
无永醇
75%7.醇，
PCR线冲液。
ENTPs 舍 dATP.dTTP,dCTP,EGTP 各 IC Hnol/L.DVA聚合酶10/uL
溴化乙键10mg/m-l.
[XA 分一呆标记。
琼脂糖。
RXA 酶 Ic m/ml..
AA抽提剂盒，
PCR扩增产物纯化试剂盒。
10XSDS:元第A.5章：
TE级冲液，pH8.0：见第A.6章。50×TAE缓冲液：见第A.7靠.
10×「样缓冲溶液：见第A.8意。引物：见第A.9章。
猪细小病毒株：20℃以下低温冰箱保存：4.2仪器和耗材
4.2.1PC仪
4. 2. 2 中仪。
4.2.3电槽。
4. 2. 4凝胶成像分析系统。
4.2.5冷冻高速高心机
4.2. 6匀浆器，
4.2.7高溢水浴锅。
4.2.8微波炉。
4.2. 9微量加样器
4.2.13微最加样器吸头：
大平，感量0,c01g
高压爽菌锅。
一20以下低温冰箱
PCR反成。
4.2. 151. 5 mL.5 mL.10 L离心管.5操作方法
实验究设施成达划SN/TI193实验空技术要求，5. 1PPV病毒株的复壮
SN/T 1874—2007
经胰酶消化长成单层的PK-15细胞，同步接程PPV,德细胞完个病变后终土培养，一20℃以下反复冻融3次以收集病毒液备用，
5.2样品的前处理
5.2.1病料样品细胞培养物
猪可疑病料释品（如：猪器官组织、死胎不乃伊、公猪精等），梓品「岛经勾浆器研胖所，灿人的含19小牛血清的Hanks液，一29%反复冻融3次，然后以500c r/nin5nin-收上清液,接种量为细胸培养液含量的10%.同步接种PK15细胞，37℃培养3d~5d,不出现病变的需要言传三代，衍细胞完病变后终止培报，一20以下反复冻融3次以「，收集培养波备而。5.2.2公猪精液
来集2ml.公猪精液，20反复冻融3次备用5.2.3猪组织样品
取「样品，经约浆π率所，亦人2mT.的TFN缓汁液悬浮，一℃反复弥融3次，然届以5 (oc r/rmin.5 tmiri,取「.清液备用5.3病毒I)NA的提取和纯化
5. 3. 1酚、三氯甲烷、异戊醇提取收经5.「和5.2处理的阳性PPV病菌和样品100μL.丁1.5mI.离心管,加人TE500 μl.混匀：入μ.10%SUS和 /白μC水浴作月min：然盾灿人RVA酶gμ)37℃作用30 rmin,待样邢冷即至空温，兆人等体积P衡谢，混句.1200c r/min,5 lir,消液，用等体积的爵：三氯中烷：戊悼(25：丝：1)再抽提1次，抽提后用等位积的另丙膜沉淀八A，室温放骨10 rrin.14 090 1/rmin,5 min,73%乙醇洗涤 1次.踪,取 30 μL 灭菌水溶解DXA,贮存」—20℃备爪或立即用」PCR扩增
5.3.2DVA抽提试剂盒提取
收经.1 和. 2 前处隐的阳性PPV病毒利样品热照[A 抽提试剂盒操作说明基求提取病毒TXA
SV/T 1874—2097
5. 4PCR 检测
5. 4. 1PCR 反应体系
检测猪细小病毒PCR反应体系见表」：以猪细小病毒TVA作为F性对照,以不含PPV的猪器它组织、PIV微感组胞NA作为阴性对照，以水作为空凹对照，表 1 PCR 反应体系
PCR 缓冲没(Mg/ pl.s)
浸向引物
DNA案合丽下载标准就来标准下载网
模板NA
灭闹大离了水
反应体系总体积
5. 4.2PC:R 反应参数
心备液浓理
各-0 mrol/L
bc mol/1.
scmol/
体系作液浓瘦
1x(Mg1为 1. 5 2:mol/)
0. 2 mtmo./L
+umol/
Ipμmol:L
o, t /ml.
却样数量/uL
NA总量Icong=Coag
PCR检测的循坏参数:95℃预变性31mir-;进人循坏.94℃:3℃,58℃3℃ .72℃:1nim+关35个循环;最后 72越仲 10 rrir，
5. 4. 3PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测将适量50×TAF稀释成0.5×TAF溶液,用0.5×TAE溶液配制1.5%坏脂糖凝胶。收ICuIPCR产物，加1L［样缀冲泥匀后点样在另-加样孔同加DNA分了量标准点样，电下大小恨据凸脉槽长度确定，一般择制在 3 V/ctm~5 V/cn,电沫耐间依据漠酚蓝移动的位置来确定.需 1 h左亡,在电泳后，将凝胶没人溴化乙锭含为0,5!g/n-l.的0,5×1AE溶中染色[C n-in~1min。或者用0.5×TAE溶液配制溴化乙锭含量为0.5ug/ml.的1.3琼脂驰凝胶点样中泳。用凝胶成像分桥系统观密和录检测结果，
6结果判定
6.1在凝胶成像分析系统观察到特元性扩增条带并判定结果，6.2PCR底阻性对照成山视115 b特并性条带,阴件对照和率白对照成片该特异性条带。6. 3在阳性对黑,所性对照和实白对照 PCR结果正确的前提下,待测样品电冰在相减的 1 bp位置「:有条带者，可判为PPV阳性：必要时可取PCR扩曾产物进行测序验证，测序结果与已公开发表的PPV特片性片段序列(参见附录B)进行比对.序列同源性在95为以.[:可判定待测样品PPV即性6.4在阳性刘照，阴对照和空白刘照ICR结果正确的前提下，待测样品电泳后无415b特是条带的判为阿性。
A. 11 mol/t.Tris-CI缓冲:pH8. 0附录A
（规范性附录）
试剂配制
SN/T 1874—2007
称取121.1βTris-Cl,落于8G0inL水中.搅拌，缓慢加人浓盐酸42 L,冷却至室温，用稀盐酸调pII至8.C,加蒸诏水至1I.分装灭菌备用A.2 0.5 mol/L EDTA-μH8.0
在 800 mI.水中入186.「gN-EIYTA·2H,(),用磁力搅拌器撑拌,稀盐酸调整μH至8.C,圳离馏水至1.,分装火菊备用
A.31 imol/l. Nacl溶液
58.5g NaCl溶二1o0c ml.蒸水，分装火菊备用：A.4TEN样品裂解缓冲液，pH7.5
含 0. CI tmal/I. Tris. Cl,G. col mol/T. FDTA,. I imol/I. NeC...A. 5 10% SDS
13ss100ml火菌蒸馏水
A,6TE缓冲液-pH8. 0
13 m 1 o/I Tris C级冲液(pI8.0).2 mL 0.5 nol/I EDTA(5I8. C),加水定容至 1 L.分装灭菌各巾
A.750×TAE缓冲液
称取242 Tris,骨改57.mT.冰乙酸,102 tml.0.5 rmol/, FDTA(pH8.0),落」蒸馏水中,定容1L.分装灭菌备月.
A.810×上样缓冲溶液
含0.25%溴翰蓝.305升浒水溶液。A.9引物
根据以下序列合成一对引物，正义,物PI：：TGGTCTCCTTCTGIGGTAGG 3和反义引物P2：-CAGAATCACAACXAC-3扩增片断大小：1hp，川火菌云离了水成5Oml/I储存备用：
SN/T 1874—2097
(资料性附录）
猪细小病毒特异性片断序例
ca gaztcegcaa crteaccacc zaccaaazta tataateatg atraectgr aagettasty gtcgcacteg aceccaataa cacacttccaLacacaccag cagcaccleg aagigaaaca cliggll.ll. aiccalguil acelacaaaa cceacicaa. acaaLella cclelcatgc alca-Huuacc ttetccc llculzret Hgcatcuc caauac gclcal& clcggac lececugiga czlllHlic lcacel-ug zaantgcagt Ercat:cat ct:ctaagaa caggagatgal allctceaca ggatnialc aclligacac annaccacla analtzzclcartretggca aacannrega tetrtaggnr tgcctccaaa artactzeet gnacetacen cagnaggnga ce6
SN/1 18/4-200/
中华人民共和国出人境检检校
行业淮
猪细小病齿病聚合酶链反应操作规程SN/T [74-200:
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街18 号
邮政编码：100045
网址 spc.net.tn
电话：6852394668517548
中的版奈皇岛即的」师刷
年本0×123
勒张0.35
宁数下宁
20年6月第
2年6第
次印刷
印数- 2 0
3号：1心56*217803
是价8.00元
2002+281 1/NS
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猪细小病毒病聚合酶链反应操作规程Protocol of polymerase chain reaction for porcine parvovirus2007-04-06发布
华人民！和国
国家质量监督检验检疫总局
2007-10-16实施
本标准的附求A为舰范性求.际录B为资料性附求，本标准由区家认证认可监督委员会提出并灯口本标滩起草单位：中华人民共和[广西出入境检验恰疫局木称滩主要起草人：盘宝，韦梅良，梦兆飞、é文龙、刘军义。本标准系次发布的出入境检验检疫行业标准SN/T1874—2007
一范围
猪细小病毒病聚合酶链反应操作规程本标准规定广猪圳小病毒病合悔铠反成操作现程，本标准适压一猎细小病母的检测，2规范性引用文件
SN/T 1874—2007
下列文件中的条款通过本标准的引用而或为尽标准的条款，凡是注即的引用文件·其随后所的修收单（不包括误的内容)或修订版均不用丁本标准，然而，鼓慰根据本标准达成协议的各方研究是否可使出这些文件的最新版本。尼是不注口期的引用文件,其最新版玄适用于本标淫，SV/T 1193基因检测实验室技术要求3缩略语
下列统喀谱适用于本标：
Ppy Porcine Parvovirus
珺细小病毒：
PCR Polymerasc Chain Keaction聚合爵链反应，
DNAdeoxyribonucleic acidl
脱氨核糖核酸。
dNTp deoxyribonucleoside triphosphate acid脱氨核皆三磷酸。
dATP deoxyadenosine triphosphoric acidl脱氧腺作一磷酸。
dGTp deoxyguanosine triphosphoric acid聪氧鸟作一磷酸。
dCTP deoxycylidine triphosphate acidl脱氧胞作一磷酸。
dTTP dexythymidine triphosphale acid脱氧作一磷酸。
hpbase pair
碱其对，
SN/T 1874—2097
HlTAHthylcnc rliaininctctraacctic arid乙二胺四乙酸，
SDs Sodiun Dodecyl Sulrale
十二烷装硫酸钢。
TrisTris(hydroxynethylamino)nmethane acetate三羟平基氨基十烷，
Na,-EDTA · 2H,oDisodium cthylcncdiamine tciraacctalc二水乙二胺叫乙酸二钠。
4试验材料
4.1试剂、溶液、缓冲液
所有实验试剂均对分柠纯：除特别说明外，窦验用水对二欧蒸罐求改去离子水，4. 1. 1 1 ro./l. T-is-C. 缓冲液-pH8.0:见第 A. I章0.511o1/LETA,pII8.0:沈第 A.2章4. 1. 2
1 o/I 氯亿钠(VaC1)溶液：见第 A.3章,4. 1. 3
T1V样另裂辩缓汀羧,P17,5:见篇 A,4 章。20g/1.蛋白海K，
饱和酚。
三氯中烧：
只设辟
无永醇
75%7.醇，
PCR线冲液。
ENTPs 舍 dATP.dTTP,dCTP,EGTP 各 IC Hnol/L.DVA聚合酶10/uL
溴化乙键10mg/m-l.
[XA 分一呆标记。
琼脂糖。
RXA 酶 Ic m/ml..
AA抽提剂盒，
PCR扩增产物纯化试剂盒。
10XSDS:元第A.5章：
TE级冲液，pH8.0：见第A.6章。50×TAE缓冲液：见第A.7靠.
10×「样缓冲溶液：见第A.8意。引物：见第A.9章。
猪细小病毒株：20℃以下低温冰箱保存：4.2仪器和耗材
4.2.1PC仪
4. 2. 2 中仪。
4.2.3电槽。
4. 2. 4凝胶成像分析系统。
4.2.5冷冻高速高心机
4.2. 6匀浆器，
4.2.7高溢水浴锅。
4.2.8微波炉。
4.2. 9微量加样器
4.2.13微最加样器吸头：
大平，感量0,c01g
高压爽菌锅。
一20以下低温冰箱
PCR反成。
4.2. 151. 5 mL.5 mL.10 L离心管.5操作方法
实验究设施成达划SN/TI193实验空技术要求，5. 1PPV病毒株的复壮
SN/T 1874—2007
经胰酶消化长成单层的PK-15细胞，同步接程PPV,德细胞完个病变后终土培养，一20℃以下反复冻融3次以收集病毒液备用，
5.2样品的前处理
5.2.1病料样品细胞培养物
猪可疑病料释品（如：猪器官组织、死胎不乃伊、公猪精等），梓品「岛经勾浆器研胖所，灿人的含19小牛血清的Hanks液，一29%反复冻融3次，然后以500c r/nin5nin-收上清液,接种量为细胸培养液含量的10%.同步接种PK15细胞，37℃培养3d~5d,不出现病变的需要言传三代，衍细胞完病变后终止培报，一20以下反复冻融3次以「，收集培养波备而。5.2.2公猪精液
来集2ml.公猪精液，20反复冻融3次备用5.2.3猪组织样品
取「样品，经约浆π率所，亦人2mT.的TFN缓汁液悬浮，一℃反复弥融3次，然届以5 (oc r/rmin.5 tmiri,取「.清液备用5.3病毒I)NA的提取和纯化
5. 3. 1酚、三氯甲烷、异戊醇提取收经5.「和5.2处理的阳性PPV病菌和样品100μL.丁1.5mI.离心管,加人TE500 μl.混匀：入μ.10%SUS和 /白μC水浴作月min：然盾灿人RVA酶gμ)37℃作用30 rmin,待样邢冷即至空温，兆人等体积P衡谢，混句.1200c r/min,5 lir,消液，用等体积的爵：三氯中烷：戊悼(25：丝：1)再抽提1次，抽提后用等位积的另丙膜沉淀八A，室温放骨10 rrin.14 090 1/rmin,5 min,73%乙醇洗涤 1次.踪,取 30 μL 灭菌水溶解DXA,贮存」—20℃备爪或立即用」PCR扩增
5.3.2DVA抽提试剂盒提取
收经.1 和. 2 前处隐的阳性PPV病毒利样品热照[A 抽提试剂盒操作说明基求提取病毒TXA
SV/T 1874—2097
5. 4PCR 检测
5. 4. 1PCR 反应体系
检测猪细小病毒PCR反应体系见表」：以猪细小病毒TVA作为F性对照,以不含PPV的猪器它组织、PIV微感组胞NA作为阴性对照，以水作为空凹对照，表 1 PCR 反应体系
PCR 缓冲没(Mg/ pl.s)
浸向引物
DNA案合丽下载标准就来标准下载网
模板NA
灭闹大离了水
反应体系总体积
5. 4.2PC:R 反应参数
心备液浓理
各-0 mrol/L
bc mol/1.
scmol/
体系作液浓瘦
1x(Mg1为 1. 5 2:mol/)
0. 2 mtmo./L
+umol/
Ipμmol:L
o, t /ml.
却样数量/uL
NA总量Icong=Coag
PCR检测的循坏参数:95℃预变性31mir-;进人循坏.94℃:3℃,58℃3℃ .72℃:1nim+关35个循环;最后 72越仲 10 rrir，
5. 4. 3PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测将适量50×TAF稀释成0.5×TAF溶液,用0.5×TAE溶液配制1.5%坏脂糖凝胶。收ICuIPCR产物，加1L［样缀冲泥匀后点样在另-加样孔同加DNA分了量标准点样，电下大小恨据凸脉槽长度确定，一般择制在 3 V/ctm~5 V/cn,电沫耐间依据漠酚蓝移动的位置来确定.需 1 h左亡,在电泳后，将凝胶没人溴化乙锭含为0,5!g/n-l.的0,5×1AE溶中染色[C n-in~1min。或者用0.5×TAE溶液配制溴化乙锭含量为0.5ug/ml.的1.3琼脂驰凝胶点样中泳。用凝胶成像分桥系统观密和录检测结果，
6结果判定
6.1在凝胶成像分析系统观察到特元性扩增条带并判定结果，6.2PCR底阻性对照成山视115 b特并性条带,阴件对照和率白对照成片该特异性条带。6. 3在阳性对黑,所性对照和实白对照 PCR结果正确的前提下,待测样品电冰在相减的 1 bp位置「:有条带者，可判为PPV阳性：必要时可取PCR扩曾产物进行测序验证，测序结果与已公开发表的PPV特片性片段序列(参见附录B)进行比对.序列同源性在95为以.[:可判定待测样品PPV即性6.4在阳性刘照，阴对照和空白刘照ICR结果正确的前提下，待测样品电泳后无415b特是条带的判为阿性。
A. 11 mol/t.Tris-CI缓冲:pH8. 0附录A
（规范性附录）
试剂配制
SN/T 1874—2007
称取121.1βTris-Cl,落于8G0inL水中.搅拌，缓慢加人浓盐酸42 L,冷却至室温，用稀盐酸调pII至8.C,加蒸诏水至1I.分装灭菌备用A.2 0.5 mol/L EDTA-μH8.0
在 800 mI.水中入186.「gN-EIYTA·2H,(),用磁力搅拌器撑拌,稀盐酸调整μH至8.C,圳离馏水至1.,分装火菊备用
A.31 imol/l. Nacl溶液
58.5g NaCl溶二1o0c ml.蒸水，分装火菊备用：A.4TEN样品裂解缓冲液，pH7.5
含 0. CI tmal/I. Tris. Cl,G. col mol/T. FDTA,. I imol/I. NeC...A. 5 10% SDS
13ss100ml火菌蒸馏水
A,6TE缓冲液-pH8. 0
13 m 1 o/I Tris C级冲液(pI8.0).2 mL 0.5 nol/I EDTA(5I8. C),加水定容至 1 L.分装灭菌各巾
A.750×TAE缓冲液
称取242 Tris,骨改57.mT.冰乙酸,102 tml.0.5 rmol/, FDTA(pH8.0),落」蒸馏水中,定容1L.分装灭菌备月.
A.810×上样缓冲溶液
含0.25%溴翰蓝.305升浒水溶液。A.9引物
根据以下序列合成一对引物，正义,物PI：：TGGTCTCCTTCTGIGGTAGG 3和反义引物P2：-CAGAATCACAACXAC-3扩增片断大小：1hp，川火菌云离了水成5Oml/I储存备用：
SN/T 1874—2097
(资料性附录）
猪细小病毒特异性片断序例
ca gaztcegcaa crteaccacc zaccaaazta tataateatg atraectgr aagettasty gtcgcacteg aceccaataa cacacttccaLacacaccag cagcaccleg aagigaaaca cliggll.ll. aiccalguil acelacaaaa cceacicaa. acaaLella cclelcatgc alca-Huuacc ttetccc llculzret Hgcatcuc caauac gclcal& clcggac lececugiga czlllHlic lcacel-ug zaantgcagt Ercat:cat ct:ctaagaa caggagatgal allctceaca ggatnialc aclligacac annaccacla analtzzclcartretggca aacannrega tetrtaggnr tgcctccaaa artactzeet gnacetacen cagnaggnga ce6
SN/1 18/4-200/
中华人民共和国出人境检检校
行业淮
猪细小病齿病聚合酶链反应操作规程SN/T [74-200:
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街18 号
邮政编码：100045
网址 spc.net.tn
电话：6852394668517548
中的版奈皇岛即的」师刷
年本0×123
勒张0.35
宁数下宁
20年6月第
2年6第
次印刷
印数- 2 0
3号：1心56*217803
是价8.00元
2002+281 1/NS
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