SN/T 2126-2008
基本信息
标准号： SN/T 2126-2008
中文名称：黑麦草腥黑穗病菌检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准价格：0.0 元
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标准简介
SN/T 2126-2008 黑麦草腥黑穗病菌检疫鉴定方法 SN/T2126-2008 标准下载解压密码：www.bzxz.net
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2126—2008
黑麦草腥黑穗病菌检疫鉴定方法Identification of Tilletia walkeri Castlebury and Carris2008-09-04发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2009-03-16实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
黑麦草腥黑穗病菌检疫鉴定方法SN/T2126—2008
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
2008年11月第一版
字数16千字
2008年11月第一次印刷
印数1—2000
书号：155066：2-19213
定价8.00
TKAONiKAca-
本标准的附录C和附录D为规范性附录，附录A和附录B为资料性附录，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T2126—2008
本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：易建平、周国梁、黄国明、印丽萍。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准I
1范围
黑麦草腥黑穗病菌检疫鉴定方法-iKAiKAca-
SN/T2126—2008
本标准规定了进出境植物检疫中黑麦草腥黑穗病菌（Tilletia walkeri)的检测和鉴定方法本标准适用于进出境禾本科草种和粮谷类产品中黑麦草腥黑穗病菌的鉴定。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用手本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T18085—2000植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法3缩略语
下列缩略语适用于本标准。
PCRPolymeraseChainReaction
聚合酶链式反应。
DNADeoxyribonucleicacid
脱氧核糖核酸。
dNTPDeoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核苷三磷酸。
bpbasepair
碱基对。
Taq酶
DNA聚合酶。
溴化乙锭。
4原理
黑麦草腥黑穗病菌（TilletiawalkeriCastleburyandCarris）属真菌界（Fungi），担子菌门（Basidio-mycota），黑粉菌纲（Ustomycetes），黑粉菌目（Ustilaginales），腥黑粉菌科（Filletiaceae），腥黑粉菌属（Tilletia）。被侵染的植株结实时，种子被病菌冬孢子侵占，形成菌瘦。冬孢子形态学特征和PCR反应特性是鉴定该种病原菌的依据。地理分布和寄主范围参见附录A5仪器设备
5.1多功能显微镜。
SN/T2126—2008
体视显微镜。
5.3低速离心机。
5.4往复式振荡器
干热灭菌器。
高压灭菌器。
PCR仪。
凝胶成像系统。
实时荧光PCR仪
生物培养箱。
可调微量加样器（2.5μL～200uL）。载玻片（长×宽为25.4mm×76.2mm，厚0.8mm）。盖玻片（18mmX18mm）。
网筛（孔径100μm和20μm）。
药品试剂
次氯酸钠溶液或漂白粉精片（化学纯）。吐温-20（Tween-20）。
席尔氏浮载剂（见GB/T18085—2000附录A）。无荧光显微镜物镜镜头浸泡油（Nd=1.516）。漠化乙锭（EB)。
封片剂：指甲油或阿拉伯树胶。琼脂糖。
蛋白酶K。
RNA酶。
EDTA(0.5mol/L,pH8.0)。
TE(pH 8.0)。
DNA Marker。
无水乙醇。
三氯甲烷。
异丙醇。
异戊醇。
TaqDNA聚合酶。
实验室检验
7.1样品接收
接收待检样品时，应核对记录，报检号、品名、批号、原产地、样品编号、送样员姓名、接样员姓名和接样日期。
制备平均样品
在样品预备室内将待检样品在样品袋内充分混匀，制成平均样品，每样1kg。7.3样品洗涤检验
7.3.1取样
从平均样品中称取50g作为试验样品2
7.3.2洗涤离心
-TiKAoNrKAca-
SN/T2126—2008
试验样品倒人灭菌三角瓶内，加蒸馏水100mL，再加吐温-201滴～2滴.用铝铂纸或Parafilm膜封住三角烧瓶瓶口。将三角瓶放在往复式振荡器上振荡5min，洗涤液经过孔径100um和20μm网筛过滤，用灭菌水冲洗孔径20um网筛上的截留物，洗涤三次后将截留物转移至离心管内，1000r/min离心5min，弃上清，取沉淀物。
7.3.3定容
沉淀物中加人席尔氏浮载剂.定容至1mL～3mL。7.3.4镜检
用微量加样器吸取沉淀物悬浮液15μL～20μL至载玻片上，加盖玻片制片。在100×显微镜下镜检，检查是否有表面呈疣状突起的腥黑穗病菌冬孢子。每份试验样品的离心沉淀物至少检查5张玻片每片按视野依次全部检查。
7.4菌瘦检查
镜检发现每个玻片超过10个具疣状突起孢壁纹饰的腥黑穗病菌冬孢子，将剩余平均样品倒白瓷盘内，在充足光线下仔细检查有无菌瘦。受腥黑穗病菌侵染的种子被病菌穗状冬孢子代替而成为菌瘦，菌瘦位于子房内，外被一层不明显致密的寄主种皮，通常是部分受害，感染部分多数局限于种子的内一侧，外观症状不明显。冬孢子堆暗褐色（茶褐色，咖啡色），无明显气味。7.5冬孢子形态测量
发现腥黑穗病菌菌瘦，直接挑取少许冬孢子加适量席尔氏液制片，封片剂封片。未发现腥黑穗病菌菌瘦，显微镜或解剖镜下从洗涤液中挑取冬孢子加适量席尔氏液制片，封片剂封片。显微镜下观察冬孢子形态特征并随机测量30个冬孢子的直径。每个成熟冬胞子按长短轴方向测量冬孢子直径大小，两者平均值为该冬孢子直径，并计算出30个冬孢子的平均直径。7.6冬孢子转移和萌发
如发现菌瘦，直接用菌瘦孢子萌发，从菌瘦中取少许冬孢子萌发，加人100μuL灭菌水，制成孢子悬浮液，用移液器将水和其中的冬孢子一起转移至3%水琼脂平板上，22℃连续光照条件下培养，培养3d后每天检查有无冬孢子萌发。
如未发现菌瘦，7.3.4中镜检发现有孢壁纹饰为疣状突起的腥黑穗病菌冬孢子，重新取样按7.3.1和7.3.2洗涤，用灭菌水悬浮沉淀物，取50μL～100μL沉淀物悬浮液在载玻片涂片，置显微镜50×或解剖镜30×下用细的挑针将冬孢子转移至无菌的塑料培养皿内的灭菌水中，挑取30个以上的冬孢子，然后在解剖镜下用0.25%的次氯酸钠溶液100uL表面消毒1min.用移液器吸去次氯酸钠溶液，再用灭菌水洗涤三次，最后加人100L200uL灭菌水，用移液器将水和其中的冬孢子一起转移至3%水琼脂平板上，培养和检查方法同前。7.7菌丝培养
萌发的冬孢子转移至PDA培养基上22℃连续光照条件下培养，7d～10d后收集菌丝。7.8DNA提取
菌丝液氮研磨后取50mg～100mg提取DNA，提取方法可以参见附录B，也可用提取真菌或植物组织的DNA提取试剂盒。
7.9PCR检测
7.9.1菌丝培养物的PCR检测
7.9.1.1引物和扩增
扩增引物为W1/W4，引物序列见附录C，PCR反应体系为：PCR反应总体积为30uL，包含：10mmol/LTris-HCl50mmol/LKCl(pH8.3);1.5mmol/LMgCl2;dATP,dGTP,dCTPdTTP浓度为100μmol/L；引物浓度100nmol/L（引物U2/U10为160nmol/L）；10ng~20ng模板DNA：O.5UTagDNA聚合酶，设阳性、阴性和空白对照.阳性为黑麦草腥黑穗病菌菌丝DNA·阴性为小麦印3
SN/T2126—2008
变腥黑穗病菌菌丝DNA，空白对照为灭菌双蒸水代替DNA膜板。加双蒸水至终体积为30uL，混勾离心，置于PCR仪进行扩增。
反应循环参数为94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；最后2℃3min。7.9.1.2琼脂糖凝胶电泳
取扩增产物10uL，加人3uL上样缓冲液［0.25%溴酚蓝，40%（质量浓度）蔗糖水溶液，混勾，1.5%琼脂糖凝胶电泳。电泳，EB染色（或类似染料，比如goldview）后于凝胶成像仪中成像存盘。7.9.2冬孢子的PCR检测
7.9.2.1冬孢子的扩增前处理
解剖镜20×～30×下将单个冬孢子挑至已灭菌的盖玻片小块（1mm2～2mm2）上，用另一块小玻片盖住冬孢子，用小镊子轻轻按压小玻片使孢子破裂，将两块小玻片连同破的孢子一起转移进PCR反应管中，加人PCR混和液，进行扩增。每个样品至少处理12个完整冬孢子，每个处理一个冬孢子。7.9.2.2引物和扩增
第一轮扩增引物为U2/U10和Ti11/Ti14.引物序列见附录C引物比例为U2/U10和Ti11/Ti14=1.6：1.6：1：1，PCR反应体系和反应循环参数同7.9.1.1.反应循环数为25。设阳性、阴性和空白对照，阳性为黑麦草腥黑穗病菌菌丝DNA，阴性为小麦印度腥黑穗病菌菌丝DNA，空白对照为灭菌双蒸水。取第一轮扩增产物1μL为第二轮PCR反应的模板进行扩增，W1/W4为第二轮PCR引物，PCR反应体系和反应循环参数同7.9.1.1。7.9.2.3实时荧光PCR扩增
同时取第一轮扩增产物1μL为实时荧光PCR反应的模板进行扩增，引物和探针序列见附录C，实时荧光PCR扩增体系25uL：5XrealtimePCR缓冲液（Mg+free）5μL.Mg+溶液（250mmol/L）0.5μL.dNTPmixture（各10mmol/L)0.75μL,TaqDNA聚合酶（5U/μL)0.25μL，上、下游引物(D-FP和T-RP)(10μmol/L)各0.5μL，探针TWAL(5μmol/L)0.6μL,DNA模板1.0μL，超纯水补至25uL.设阳性、阴性和空白对照。实时荧光PCR扩增在ABIPRISM7700定量PCR扩增仪或其他实时荧光PCR扩增仪上进行。两步法扩增反应程序：50℃2min，预变性95℃10min；然后95℃15s.65℃1min循环40次。
7.9.2.4琼脂糖凝胶电泳
电泳和观察结果同7.9.1.2。
8鉴定特征
8.1冬孢子形态学特征
冬孢子球形至近球形，浅黄至暗红褐色，不透明至半透明，23.7μm～44.0μm（平均34.0μm）。外胞壁具锥形至平截状突起，3m～6m高，表面观为粗糙，不完全脑纹状至珊瑚状，外被透明至微黄褐色胶质鞘，延伸至突起顶部。黑麦草腥黑穗病菌和近似种冬孢子的形态特征比较见附录D。8.2冬孢子萌发生理特性
冬孢子20℃～25℃下培养2d～5d以后萌发，冬孢子萌发长出先菌丝，先菌丝上产生末端稍卷曲的丝状初生担孢子，数量60～150，大小（38μm～75um）×（1.3um～1.8μm）平均（44.3m~67.8μm）×（1.3μm～1.7μm），初生担孢子在24h内萌发，强力弹射出腊肠状次生担孢子，次生担孢子可以萌发产生次生担孢子或菌丝，菌丝又可以产生丝状次生担孢子，在初生担孢子和次生担孢子彼此之间没有融合现象。腊肠状次生担孢子大小(10.6μm17.6μm）X（1.8μm3.1uμm），丝状次生担孢子大小（26um~57.2uμm）×（1.8μm~2.6μm）。9结果评定
9.1发现菌瘘
发现菌瘦，寄主为黑麦草属，冬孢子形态特征与8.1相符合，判定为黑麦草腥黑穗病菌。4
9.2未发现菌瘘
-KAoNYKAca-
SN/T2126—2008
根据冬孢子形态特征不能鉴定以PCR扩增结果为准，菌丝的PCR、孢子的巢式PCR（nestedPCR）和实时荧光PCR试验中任何一个扩增试验为阳性者可以判定为黑麦草腥黑穗病菌。未发现菌瘦，根据冬孢子形态特征不能鉴定的视PCR扩增结果，菌丝的PCR，孢子的套式PCR(nestedPCR)和实时荧光PCR试验中任何一个扩增试验为阳性者可以判定为黑麦草腥黑穗病菌。10样品保存
保存样品应按报检号、品种、批号分别存放，每样1kg。保存样品经登记和经手人签字后置低温于燥、防虫防鼠处妥善保存3个月。如发现病菌冬孢子，该样品至少保存12个月，以备复验、谈判和仲裁保存期满后，需经灭菌处理。
SN/T2126—2008
A.1地理分布
附录A
（资料性附录）
黑麦草腥黑穗病菌地理分布和寄主范围美国、澳大利亚和新西兰等。
A.2寄主范围
黑麦草腥黑穗病菌只侵染黑麦草属。附录B
（资料性附录）
菌丝DNA提取方法
B.1离心收集菌丝，转移菌丝至研钵中，液氮冷冻，磨碎菌丝。B.2取50mg~100mg粉状菌丝转人小管，加500μLTES(100mmolTris.pH8.0,10mmolEDTA，2%SDS)，加50μg~100μg蛋白酶K，55℃~60℃孵育1h，期间轻轻摇动混匀。B.3调节盐浓度至1.4mol/L，加1/10体积10%CTAB，65℃10min。B.41体积SEVAG（三氯甲烷：异戊醇=24：1，轻摇混匀，0℃孵育30min，4℃12000r/min离心10min。
B.5取上清液至1.5mL离心管.加225uL5molNH4Ac，轻摇混匀.0℃置30min，4℃12000r/min离心10min。
B.6取上清液，加3μLRNA酶，37℃孵育15min.4℃12000r/min离心10min。B.7取上清液.加0.55体积异丙醇沉淀DNA，立即12000r/min离心5min，如无DNA团出现，立即0℃置30min。
B.8弃上清液，冷70%乙醇洗2次，干燥后溶解于50μLTE中。6
引物编号
寸录C
（规范性附录）
扩增试验引物和探针
核苷酸序列5\-3\
cagcaaatgactcgaacagca
ctcaagtcagatctttcaat
gtgatcctagctgagctaac
gccatgaaaacacgcagtcc
aaggtctgtaggtgaacct
gatatgcttaagttcagcggg
ttctcttttatcccaacaccaaact
cttatcgcattcgctgcg
(FAM)-cggaaggaacaaggc(MGB)
a正义引物forwardprimer
b反义引物reverseprimer。
Nucleotide location in AF218063dNucleotidelocation inAF398434。eNucleotide location inAF135434f Nucleotide location inAF135435位置
198~2199
938957
103~122°
1424~1443
10~30d
668-6884
53~779
270~288
TYKAONT KACa-
SN/T2126—2008
产物/bp
SN/T2126—2008
T.walkeri
黑麦草腥黑穗
小麦印度腥黑穗
T.horrida
水稻腥黑穗病菌
T.ehrhartae
沙地牧草腥黑穗
T,barclayana
狼尾草腥黑穗
T.setariae
狗尾草腥黑穗病菌
T.sumatii
苏玛特腥黑穗
T.savilei
附录D
（规范性附录）
黑麦草腥黑穗病菌和近似种冬孢子的形态特征比较大小/μm
平均34
平均35～39
平均25
平均23
17.6~32.3
平均24.7
18.5~32.1
平均22.5
18.6~29.4
平均23.3
21.6~34.3
平均25.3
17.6~26.5
平均22.1
SN/T 2126-2008
淡褐色至暗
褐色，但不会呈
不透明的黑色
褐色至黑
色，不透明
褐色至黑
色，不透明
浅褐色至
深褐色
浅褐色至
深褐色
浅褐色至
深褐色
浅褐色至www.bzxz.net
深褐色
浅褐色至
深褐色
浅褐色至
深褐色
很规则球
球形至亚
球形至亚
球形至亚
球形至亚
球形至亚
球形至亚
球形至亚
球形至亚
刺状突起
剖面观常呈钝圆，表面观为
脊状突起，有时和印腥相似
浓密.1.5μm~7.0μm，表
面观为疣状纹饰
可能弯曲·顶端常为较大的
剖面观呈钝圆，表面观为脊
状突起，排列规则
疣状突起短，垂直或略为倾
斜着生，基部呈不大规则多
疣状突起低矮，垂直着生。
基部呈规则五角或六角形，排
列紧密
疣状突起低矮，垂直着生
基部呈规则五角或六角形.排
列紧密
疣状突起低矮，不明显，垂
直或略为倾斜着生，基部呈多
角形.排列紧密
疣状突起明显，垂直着生，
基部呈规则五角或六角形，排
列紧密
黑麦草
沙地牧草
狼尾草
狗尾草
Spmifer
littoreeus
lacryjobi
Tripogon
jacquemontil
书号：155066·2-19213
定价：
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黑麦草腥黑穗病菌检疫鉴定方法Identification of Tilletia walkeri Castlebury and Carris2008-09-04发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2009-03-16实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
黑麦草腥黑穗病菌检疫鉴定方法SN/T2126—2008
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
2008年11月第一版
字数16千字
2008年11月第一次印刷
印数1—2000
书号：155066：2-19213
定价8.00
TKAONiKAca-
本标准的附录C和附录D为规范性附录，附录A和附录B为资料性附录，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T2126—2008
本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：易建平、周国梁、黄国明、印丽萍。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准I
1范围
黑麦草腥黑穗病菌检疫鉴定方法-iKAiKAca-
SN/T2126—2008
本标准规定了进出境植物检疫中黑麦草腥黑穗病菌（Tilletia walkeri)的检测和鉴定方法本标准适用于进出境禾本科草种和粮谷类产品中黑麦草腥黑穗病菌的鉴定。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用手本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T18085—2000植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法3缩略语
下列缩略语适用于本标准。
PCRPolymeraseChainReaction
聚合酶链式反应。
DNADeoxyribonucleicacid
脱氧核糖核酸。
dNTPDeoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核苷三磷酸。
bpbasepair
碱基对。
Taq酶
DNA聚合酶。
溴化乙锭。
4原理
黑麦草腥黑穗病菌（TilletiawalkeriCastleburyandCarris）属真菌界（Fungi），担子菌门（Basidio-mycota），黑粉菌纲（Ustomycetes），黑粉菌目（Ustilaginales），腥黑粉菌科（Filletiaceae），腥黑粉菌属（Tilletia）。被侵染的植株结实时，种子被病菌冬孢子侵占，形成菌瘦。冬孢子形态学特征和PCR反应特性是鉴定该种病原菌的依据。地理分布和寄主范围参见附录A5仪器设备
5.1多功能显微镜。
SN/T2126—2008
体视显微镜。
5.3低速离心机。
5.4往复式振荡器
干热灭菌器。
高压灭菌器。
PCR仪。
凝胶成像系统。
实时荧光PCR仪
生物培养箱。
可调微量加样器（2.5μL～200uL）。载玻片（长×宽为25.4mm×76.2mm，厚0.8mm）。盖玻片（18mmX18mm）。
网筛（孔径100μm和20μm）。
药品试剂
次氯酸钠溶液或漂白粉精片（化学纯）。吐温-20（Tween-20）。
席尔氏浮载剂（见GB/T18085—2000附录A）。无荧光显微镜物镜镜头浸泡油（Nd=1.516）。漠化乙锭（EB)。
封片剂：指甲油或阿拉伯树胶。琼脂糖。
蛋白酶K。
RNA酶。
EDTA(0.5mol/L,pH8.0)。
TE(pH 8.0)。
DNA Marker。
无水乙醇。
三氯甲烷。
异丙醇。
异戊醇。
TaqDNA聚合酶。
实验室检验
7.1样品接收
接收待检样品时，应核对记录，报检号、品名、批号、原产地、样品编号、送样员姓名、接样员姓名和接样日期。
制备平均样品
在样品预备室内将待检样品在样品袋内充分混匀，制成平均样品，每样1kg。7.3样品洗涤检验
7.3.1取样
从平均样品中称取50g作为试验样品2
7.3.2洗涤离心
-TiKAoNrKAca-
SN/T2126—2008
试验样品倒人灭菌三角瓶内，加蒸馏水100mL，再加吐温-201滴～2滴.用铝铂纸或Parafilm膜封住三角烧瓶瓶口。将三角瓶放在往复式振荡器上振荡5min，洗涤液经过孔径100um和20μm网筛过滤，用灭菌水冲洗孔径20um网筛上的截留物，洗涤三次后将截留物转移至离心管内，1000r/min离心5min，弃上清，取沉淀物。
7.3.3定容
沉淀物中加人席尔氏浮载剂.定容至1mL～3mL。7.3.4镜检
用微量加样器吸取沉淀物悬浮液15μL～20μL至载玻片上，加盖玻片制片。在100×显微镜下镜检，检查是否有表面呈疣状突起的腥黑穗病菌冬孢子。每份试验样品的离心沉淀物至少检查5张玻片每片按视野依次全部检查。
7.4菌瘦检查
镜检发现每个玻片超过10个具疣状突起孢壁纹饰的腥黑穗病菌冬孢子，将剩余平均样品倒白瓷盘内，在充足光线下仔细检查有无菌瘦。受腥黑穗病菌侵染的种子被病菌穗状冬孢子代替而成为菌瘦，菌瘦位于子房内，外被一层不明显致密的寄主种皮，通常是部分受害，感染部分多数局限于种子的内一侧，外观症状不明显。冬孢子堆暗褐色（茶褐色，咖啡色），无明显气味。7.5冬孢子形态测量
发现腥黑穗病菌菌瘦，直接挑取少许冬孢子加适量席尔氏液制片，封片剂封片。未发现腥黑穗病菌菌瘦，显微镜或解剖镜下从洗涤液中挑取冬孢子加适量席尔氏液制片，封片剂封片。显微镜下观察冬孢子形态特征并随机测量30个冬孢子的直径。每个成熟冬胞子按长短轴方向测量冬孢子直径大小，两者平均值为该冬孢子直径，并计算出30个冬孢子的平均直径。7.6冬孢子转移和萌发
如发现菌瘦，直接用菌瘦孢子萌发，从菌瘦中取少许冬孢子萌发，加人100μuL灭菌水，制成孢子悬浮液，用移液器将水和其中的冬孢子一起转移至3%水琼脂平板上，22℃连续光照条件下培养，培养3d后每天检查有无冬孢子萌发。
如未发现菌瘦，7.3.4中镜检发现有孢壁纹饰为疣状突起的腥黑穗病菌冬孢子，重新取样按7.3.1和7.3.2洗涤，用灭菌水悬浮沉淀物，取50μL～100μL沉淀物悬浮液在载玻片涂片，置显微镜50×或解剖镜30×下用细的挑针将冬孢子转移至无菌的塑料培养皿内的灭菌水中，挑取30个以上的冬孢子，然后在解剖镜下用0.25%的次氯酸钠溶液100uL表面消毒1min.用移液器吸去次氯酸钠溶液，再用灭菌水洗涤三次，最后加人100L200uL灭菌水，用移液器将水和其中的冬孢子一起转移至3%水琼脂平板上，培养和检查方法同前。7.7菌丝培养
萌发的冬孢子转移至PDA培养基上22℃连续光照条件下培养，7d～10d后收集菌丝。7.8DNA提取
菌丝液氮研磨后取50mg～100mg提取DNA，提取方法可以参见附录B，也可用提取真菌或植物组织的DNA提取试剂盒。
7.9PCR检测
7.9.1菌丝培养物的PCR检测
7.9.1.1引物和扩增
扩增引物为W1/W4，引物序列见附录C，PCR反应体系为：PCR反应总体积为30uL，包含：10mmol/LTris-HCl50mmol/LKCl(pH8.3);1.5mmol/LMgCl2;dATP,dGTP,dCTPdTTP浓度为100μmol/L；引物浓度100nmol/L（引物U2/U10为160nmol/L）；10ng~20ng模板DNA：O.5UTagDNA聚合酶，设阳性、阴性和空白对照.阳性为黑麦草腥黑穗病菌菌丝DNA·阴性为小麦印3
SN/T2126—2008
变腥黑穗病菌菌丝DNA，空白对照为灭菌双蒸水代替DNA膜板。加双蒸水至终体积为30uL，混勾离心，置于PCR仪进行扩增。
反应循环参数为94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；最后2℃3min。7.9.1.2琼脂糖凝胶电泳
取扩增产物10uL，加人3uL上样缓冲液［0.25%溴酚蓝，40%（质量浓度）蔗糖水溶液，混勾，1.5%琼脂糖凝胶电泳。电泳，EB染色（或类似染料，比如goldview）后于凝胶成像仪中成像存盘。7.9.2冬孢子的PCR检测
7.9.2.1冬孢子的扩增前处理
解剖镜20×～30×下将单个冬孢子挑至已灭菌的盖玻片小块（1mm2～2mm2）上，用另一块小玻片盖住冬孢子，用小镊子轻轻按压小玻片使孢子破裂，将两块小玻片连同破的孢子一起转移进PCR反应管中，加人PCR混和液，进行扩增。每个样品至少处理12个完整冬孢子，每个处理一个冬孢子。7.9.2.2引物和扩增
第一轮扩增引物为U2/U10和Ti11/Ti14.引物序列见附录C引物比例为U2/U10和Ti11/Ti14=1.6：1.6：1：1，PCR反应体系和反应循环参数同7.9.1.1.反应循环数为25。设阳性、阴性和空白对照，阳性为黑麦草腥黑穗病菌菌丝DNA，阴性为小麦印度腥黑穗病菌菌丝DNA，空白对照为灭菌双蒸水。取第一轮扩增产物1μL为第二轮PCR反应的模板进行扩增，W1/W4为第二轮PCR引物，PCR反应体系和反应循环参数同7.9.1.1。7.9.2.3实时荧光PCR扩增
同时取第一轮扩增产物1μL为实时荧光PCR反应的模板进行扩增，引物和探针序列见附录C，实时荧光PCR扩增体系25uL：5XrealtimePCR缓冲液（Mg+free）5μL.Mg+溶液（250mmol/L）0.5μL.dNTPmixture（各10mmol/L)0.75μL,TaqDNA聚合酶（5U/μL)0.25μL，上、下游引物(D-FP和T-RP)(10μmol/L)各0.5μL，探针TWAL(5μmol/L)0.6μL,DNA模板1.0μL，超纯水补至25uL.设阳性、阴性和空白对照。实时荧光PCR扩增在ABIPRISM7700定量PCR扩增仪或其他实时荧光PCR扩增仪上进行。两步法扩增反应程序：50℃2min，预变性95℃10min；然后95℃15s.65℃1min循环40次。
7.9.2.4琼脂糖凝胶电泳
电泳和观察结果同7.9.1.2。
8鉴定特征
8.1冬孢子形态学特征
冬孢子球形至近球形，浅黄至暗红褐色，不透明至半透明，23.7μm～44.0μm（平均34.0μm）。外胞壁具锥形至平截状突起，3m～6m高，表面观为粗糙，不完全脑纹状至珊瑚状，外被透明至微黄褐色胶质鞘，延伸至突起顶部。黑麦草腥黑穗病菌和近似种冬孢子的形态特征比较见附录D。8.2冬孢子萌发生理特性
冬孢子20℃～25℃下培养2d～5d以后萌发，冬孢子萌发长出先菌丝，先菌丝上产生末端稍卷曲的丝状初生担孢子，数量60～150，大小（38μm～75um）×（1.3um～1.8μm）平均（44.3m~67.8μm）×（1.3μm～1.7μm），初生担孢子在24h内萌发，强力弹射出腊肠状次生担孢子，次生担孢子可以萌发产生次生担孢子或菌丝，菌丝又可以产生丝状次生担孢子，在初生担孢子和次生担孢子彼此之间没有融合现象。腊肠状次生担孢子大小(10.6μm17.6μm）X（1.8μm3.1uμm），丝状次生担孢子大小（26um~57.2uμm）×（1.8μm~2.6μm）。9结果评定
9.1发现菌瘘
发现菌瘦，寄主为黑麦草属，冬孢子形态特征与8.1相符合，判定为黑麦草腥黑穗病菌。4
9.2未发现菌瘘
-KAoNYKAca-
SN/T2126—2008
根据冬孢子形态特征不能鉴定以PCR扩增结果为准，菌丝的PCR、孢子的巢式PCR（nestedPCR）和实时荧光PCR试验中任何一个扩增试验为阳性者可以判定为黑麦草腥黑穗病菌。未发现菌瘦，根据冬孢子形态特征不能鉴定的视PCR扩增结果，菌丝的PCR，孢子的套式PCR(nestedPCR)和实时荧光PCR试验中任何一个扩增试验为阳性者可以判定为黑麦草腥黑穗病菌。10样品保存
保存样品应按报检号、品种、批号分别存放，每样1kg。保存样品经登记和经手人签字后置低温于燥、防虫防鼠处妥善保存3个月。如发现病菌冬孢子，该样品至少保存12个月，以备复验、谈判和仲裁保存期满后，需经灭菌处理。
SN/T2126—2008
A.1地理分布
附录A
（资料性附录）
黑麦草腥黑穗病菌地理分布和寄主范围美国、澳大利亚和新西兰等。
A.2寄主范围
黑麦草腥黑穗病菌只侵染黑麦草属。附录B
（资料性附录）
菌丝DNA提取方法
B.1离心收集菌丝，转移菌丝至研钵中，液氮冷冻，磨碎菌丝。B.2取50mg~100mg粉状菌丝转人小管，加500μLTES(100mmolTris.pH8.0,10mmolEDTA，2%SDS)，加50μg~100μg蛋白酶K，55℃~60℃孵育1h，期间轻轻摇动混匀。B.3调节盐浓度至1.4mol/L，加1/10体积10%CTAB，65℃10min。B.41体积SEVAG（三氯甲烷：异戊醇=24：1，轻摇混匀，0℃孵育30min，4℃12000r/min离心10min。
B.5取上清液至1.5mL离心管.加225uL5molNH4Ac，轻摇混匀.0℃置30min，4℃12000r/min离心10min。
B.6取上清液，加3μLRNA酶，37℃孵育15min.4℃12000r/min离心10min。B.7取上清液.加0.55体积异丙醇沉淀DNA，立即12000r/min离心5min，如无DNA团出现，立即0℃置30min。
B.8弃上清液，冷70%乙醇洗2次，干燥后溶解于50μLTE中。6
引物编号
寸录C
（规范性附录）
扩增试验引物和探针
核苷酸序列5\-3\
cagcaaatgactcgaacagca
ctcaagtcagatctttcaat
gtgatcctagctgagctaac
gccatgaaaacacgcagtcc
aaggtctgtaggtgaacct
gatatgcttaagttcagcggg
ttctcttttatcccaacaccaaact
cttatcgcattcgctgcg
(FAM)-cggaaggaacaaggc(MGB)
a正义引物forwardprimer
b反义引物reverseprimer。
Nucleotide location in AF218063dNucleotidelocation inAF398434。eNucleotide location inAF135434f Nucleotide location inAF135435位置
198~2199
938957
103~122°
1424~1443
10~30d
668-6884
53~779
270~288
TYKAONT KACa-
SN/T2126—2008
产物/bp
SN/T2126—2008
T.walkeri
黑麦草腥黑穗
小麦印度腥黑穗
T.horrida
水稻腥黑穗病菌
T.ehrhartae
沙地牧草腥黑穗
T,barclayana
狼尾草腥黑穗
T.setariae
狗尾草腥黑穗病菌
T.sumatii
苏玛特腥黑穗
T.savilei
附录D
（规范性附录）
黑麦草腥黑穗病菌和近似种冬孢子的形态特征比较大小/μm
平均34
平均35～39
平均25
平均23
17.6~32.3
平均24.7
18.5~32.1
平均22.5
18.6~29.4
平均23.3
21.6~34.3
平均25.3
17.6~26.5
平均22.1
SN/T 2126-2008
淡褐色至暗
褐色，但不会呈
不透明的黑色
褐色至黑
色，不透明
褐色至黑
色，不透明
浅褐色至
深褐色
浅褐色至
深褐色
浅褐色至
深褐色
浅褐色至www.bzxz.net
深褐色
浅褐色至
深褐色
浅褐色至
深褐色
很规则球
球形至亚
球形至亚
球形至亚
球形至亚
球形至亚
球形至亚
球形至亚
球形至亚
刺状突起
剖面观常呈钝圆，表面观为
脊状突起，有时和印腥相似
浓密.1.5μm~7.0μm，表
面观为疣状纹饰
可能弯曲·顶端常为较大的
剖面观呈钝圆，表面观为脊
状突起，排列规则
疣状突起短，垂直或略为倾
斜着生，基部呈不大规则多
疣状突起低矮，垂直着生。
基部呈规则五角或六角形，排
列紧密
疣状突起低矮，垂直着生
基部呈规则五角或六角形.排
列紧密
疣状突起低矮，不明显，垂
直或略为倾斜着生，基部呈多
角形.排列紧密
疣状突起明显，垂直着生，
基部呈规则五角或六角形，排
列紧密
黑麦草
沙地牧草
狼尾草
狗尾草
Spmifer
littoreeus
lacryjobi
Tripogon
jacquemontil
书号：155066·2-19213
定价：
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