SN/T 2300-2009
基本信息
标准号： SN/T 2300-2009
中文名称：国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
发布日期：2009-07-07
出版语种：简体中文
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相关标签： 国境 口岸 蚊类 携带 基孔 肯雅 病毒 检测 方法
标准分类号
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标准价格：0.0 元
相关单位信息
发布部门：国家质量监督检验检疫总局
标准简介
SN/T 2300-2009 国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法 SN/T2300-2009 标准下载解压密码：www.bzxz.net
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2300-2009bzxz.net
国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法
Detection of mosquito-borne chikungunya virus at frontier port2009-07-07发布
中华人民共和国國
数码防伤
国家质量监督检验检疫总局
2010-01-16实施
本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局。SN/T.2300—2009
本标准主要起草人：黄吉城、郑夔、洪烨、李小波、幸芦琴、师永霞、钟玉清、相大鹏、郭波旋、胡龙飞、陈永红。
本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1范围
国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法
SN/T2300—2009
本标准规定了国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法，包括标本采集、处理、检测程序、结果判定及报告。
本标准适用于国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的实验室检验，2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。比是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不通用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是未注日期的引用件，其最新版本适用于本标准。GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本标推
基孔肯雅病毒chikungunyavirus基孔肯雅病毒是单股RNA病毒，属于披膜病毒科甲病毒属。病毒颗粒呈球形，平均直径42nm，相对分子质量为4.3×108，沉降系数为469。该病毒感染人可引起基乳肯雅热，主要临床表现为发热、关节疼痛、皮疹和轻度出血等。本病潜伏期3d3.2
12d，伊救是其主要传播媒介。
实时荧光RT-PCRreal-timefluprescenteRT-PCR实时荧光 RT-PCR方法是在常规RT-PCR的础上，姗人条特异性的荧光探针。该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个报皆基团和一个淬火荧荣光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，利用Vag酶的5’3'外切酶活性将探纤酶切降解，使报告荧光基团和灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光储号。每个反应内的荧光信号达到设定的阐值时所经历的循环数，用Ct值（cyclethreshold）表示。4实验室生物安全要求
4.1基孔肯雅病毒培养和动物感染实验应在生物安全三级(BSL-3)实验室内进行。4.2未经培养的基孔肯雅病毒感染性材料的操作应在生物安全二级(BSL-2)实验室内进行。4.3基孔肯雅病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级(BSL-1)实验室内进行。4.4
基孔肯雅病毒感染性材料运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。其他要求按GB19489进行。
主要仪器设备
主要仪器设备如下：
荧光定量PCR仪；
SN/T2300—2009
二级生物安全柜；
CO2培养箱；
倒置显微镜；
高压灭菌器；
-70℃超低温冰箱（或液氮罐）；冷冻离心机（带密封的离心安全杯，最大离心力20000g)：玻璃研磨器；
涡旋器。
6·.主要试剂
6：1标本处理液：在新鲜配制的95mLMEM（最低必须培养基，配方见附录A）中加入56℃热灭活30min的胎牛血清2mL、1mL庆大霉素（5000μg/mL）、1mL两性霉素B(250μg/mL）和1mL青链霉素（青霉素G10000U/mL、链霉素r0000μg/mL），用7.5%碳酸氢钠溶液调至pH7.2。6.2Hank's液：配方见附录A。
6.3核酸提取试剂：用QIAampViralRNAKit，详见试剂盒说明书1），内含AVL、AW1、AW2和AVE等成分。
6.4Ag-Path-IDTMOnestepRT-PCRKit，美国Ambion公司产品1）6.5 DEPC水。
6.6实时荧光RT-PCR检测的引物和探针：CHIK-FP5'-TTTAGCCGTAATGAGCRTCGG-3”CHIK-RP5'-CCGTGTTCGGGATCACTGTTA-3*CHIK-probe5'FAM-TGCCCACACTGTGA-BHQ1-3’（LNA探针，下划线斜黑体字母表示LNA修饰碱基）。
7i标本的采集与处理
7.1根据监测任务等实际工作需要采集所需数量的蚊子标本（参见附录B）。7.2将采集的蚊子直接放入一20℃冰箱30min以上冻死后，取出，分类编号，按30只一份，装入2mL螺口塑料血清管内，旋紧管盖，做好编号，立即放人液氮罐或干冰内（一70℃以下）运输或保存。7.3标本的处理：在冰上操作。从一70℃以下超低温冰箱中取出蚊标本，倒人研磨器中，加入Hank's液1mL吹洗，弃去液体后加入1mL标本处理液，反复研磨至组织碎片基本消失，随后将研磨液吸入1.5mLeppendorf离心管，平衡后置预冷4℃的离心机上，12000r/min离心10min。取上清液提取核酸进行实时荧光RT-PCR检测，或接种组织细胞进行病毒分离。剩余的蚊标本研磨液需保存在一70℃以下超低温冰箱以备复查
8！检验程序
8.1C6/36细胞培养分离病毒
8.:1.1在96孔平底组织培养板中，每孔加人50μL蚊媒标本研磨液，每份标本平行加2孔，预留2孔作为正常细胞对照。
8.:1.2每孔加人200μLC6/36细胞（1×106个/mL）。11）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则-
可使用这些等效产品。
SN/T2300—2009
8.1.3加盖，置CO2培养箱（33℃，5%二氧化碳，湿度80%）中培养7d，每天于倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)情况并作好记录。
8.1.4不管细胞是否出现CPE，每份标本均连续传3代，3代后出现CPE的孔可将上清液吸出接种细胞瓶（管）进行增殖，或置一70℃超低冰箱保存，待作进一步鉴定，8.1.5病毒培养的结果观察：基孔肯雅病毒在C6/36细胞上的典型细胞病变(CPE)为细胞肿胀、破碎、团聚、融合、脱落。
8.1.6病变的细胞按8.2和8.3进行病毒检测。8.2病毒核酸提取
8.2.1取蚊标本研磨液或细胞培养上清140μL加人560μL裂解液（AVL），在旋涡混合器上振荡15s混匀，室温静置10min。
8.2.2加人560μL无水乙醇终止反应，在旋涡混合器上振荡15s混匀。8.2.3裂解后的液体分两次移入管柱，每次8000r/min离心1min，此时病毒RNA会吸附在管柱底部的膜上。
8.2.4加500uL洗液（AW1)至管柱上，8000r/min离心1min，弃去AW1。8.2.5加500uL洗液（AW2)至管柱上，14000r/min离心3min，弃去AW2。进一步离心14000r/min1min以彻底去除残留在膜上乙醇。.8.2.6加人60μL洗脱液（AVE），室温静置1min。8.2.7将管柱置于1.5mL离心管上，4℃离心8000r/min1min，得到的RNA即可进行实时荧光RT-PCR检测。
8.3实时荧光RT-PCR检测方法
8.3.1反应液的准备
设置20μL反应体系，每个待检标本反应液的组成为：无RNA酶的灭菌双蒸水
2XRT-PCR Buffer
20μM CHIK-FP\
20 μM CHIK-RP
5 μM CHIK-Probe
10 μL
25XRT-PCREnzymeMix0.8 μL
模板RNA
8.3.2扩增程序
在全自动荧光定量仪AppliedBiosystems7500FastReal-TimePCRSystems2）上检测时，扩增程序为：50℃10min，95℃10min，95℃10s→62℃30s45（检测荧光信号）循环。若仪器为Roche?LightCyclerRealTimePCR扩增仪2），则扩增程序为：50℃10min，95℃10min，95℃5s→62℃20s45循环。由于不同的荧光定量PCR仪性能有差异，必要时扩增程序可做适当调整。9结果判定与报告
9.1反应结果应同时符合阴性对照无扩增曲线而阳性对照Ct<35并有明显扩增曲线2个条件。否则，试验结果无效。
9.2阴性结果：样品无Ct值或Ct>45，且无明显扩增曲线，报告为基孔肯雅病毒核酸荧光RT-PCR检2）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
SN/T.2300—2009
测阴性。
9.3阳性结果：样品Ct值≤40，并有明显扩增曲线，报告为基孔肯雅病毒核酸荧光RT-PCR检测阳性。
9.4可疑结果：样品Ct值在40～45之间的标本应重做，若重做结果仍然有明显扩增曲线，则该标本判断为基孔肯雅病毒核酸荧光RT-PCR检测阳性，否则为阴性A.1MEM配方
MEM配方见表A.1。
氯化钙
氮化钾
无水硫酸镁
氯化钠
无水磷酸二氢钠
L-精氨酸盐酸盐
L-胱氨酸盐酸盐
L-谷氮酰胺
L-组氨酸盐酸盐
L-异亮氨酸
L-亮氨酸
L-赖氨酸盐酸盐
L-蛋氨酸
L-苯丙氨酸
A.2Hank's液配方
附录A
（资料性附录）
MEM和Hank's液配方
表A.1MEM配方
用（mg1）
L苏氨酸
L.色氨酸
L-丝氨酸
+葡萄糖
D泛酸钙
化胆践
-肌醇
烟能胺
盐酸吡哆
核费察
盐酸硫胺
碳酸氢钠0.35g，
磷酸二氢钾0.06g，氯化钠
氯化钾0.
.0g，
(Na2HPO4·H2O)0.06g,加水到1 000ml..HankSN/T2300—2009
用量/（mg/L）
g，葡萄糖1.0g，磷酸氢二钠
液可以高压灭菌
着，分装于4℃下保存。
SN/T2300—2009
B.1准备
B.1.1幼虫捕捞器材
附录B
（资料性附录）
蚊虫标本的采集、运输和保存
水勺和水网，宽口长、短吸管，青霉素瓶或其他小瓶，幼虫饲养笼，B.1.2成蚊采集器材
诱蚊帐，诱蚊灯，电动吸蚊器，捕蚊磁场，捕虫网、集蚊袋、手电筒等。B.1.3其他器材
液氮罐（含液氮）或干冰、螺口血清管、纱布、工作记录表、小标签纸、记录笔、油性记号笔（耐低温)等。
B.2.采集方法
蚊虫滋生地选择：
白纹伊蚊白天在人房、竹林活动：致倦库蚊在人房；中华按蚊、三带喙库蚊在既舍；小容器收集的蚊幼多为伊蚊、库蚊；大型静水（稻田、菱白田、池沼、低洼积水等收集的是中华按蚊、窄卵按蚊、三带喙库蚊；污水沟、坑、清水粪缸收集的多为淡色库蚊、致倦库蚊。B.2.2蚊虫采集
B.2.2.1电动吸蚊器人工诱捕法
选择各种蚊虫栖息的场所，如库蚊以人房、牛棚、猪舍作为捕捉点于日落后1h～1.5h开始捕捉，伊蚊以竹林、香蕉园等半家栖环境于上午和近黄昏时段用电动吸蚊器捕捉。B.2.2.2.捕蚊磁场自动诱捕法
选择各种蚊虫栖息的场所，放置一台捕蚊磁场，以液化石油气为气源和动力源，按说明连续开启捕蚊磁场自动诱捕蚊虫，诱捕2h～4h或一夜。B.2.2.3人帐法
在蚊虫滋生地附近，挂一大型蚊帐，将帐项支平，四角拉开，下缘离地面30cm～40cm，人在帐内诱蚊人帐，以吸蚊器连续捕蚊。
B.2.2.4灯诱法
将诱蚊灯悬挂于蚊虫滋生地、猪场、牛棚、居民点周围的空地上，离地1m～1.5m，傍晚开启电源进行自动诱捕，诱捕2h～4h或一夜。B.2.2.5网捕法
操作时，采集者手持网柄，伸直胳膊作“co”形挥网，每次以55次/min的频率采集。B.2.2.6勺捞法
选择各种蚊幼滋生的场所（池塘、溪流、沟渠、水潭、稻田等）用金属制的标准捞勺（容积约400mL或市售的小奶锅安一柄即成）或水网（粗铁线缝上纱布制成），于幼虫滋生的水体，在离岸1m以内，随机采集水样，如有各龄幼虫或蛹，用粗口吸管吸入广口瓶内。B.2.3蚊虫标本的现场处理
将收集于集蚊袋中的蚊子连同集蚊袋一起直接放人一20℃冰箱冰30min以上冻死后，取出，分类编号，按30.只一份，装入2mL螺口血清管内，旋紧管盖，做好编号，置液氮（或一70℃超低温冰箱或掩埋于干冰)中冻存待检。每支标本管的编号应与记录表格一一对应，原始记录表格要详细填写。6
B.2.4蚊虫标本的保存
SN/T 2300—2009
要保持蚊体内虫媒病毒的活性，分装好的蚊标本需保存在一70℃以下，直到进行标本检测。液氮的温度为一196℃，因此最好能将标本保存于液氮中；干冰的温度为一82℃，也可将标本掩埋于干冰中保存，但用干冰保存时不可直接将标本放置于干冰上，因为干冰上面的温度仅达一30℃左右，不足以长时间保持病毒的活性；一70℃以下超低温冰箱是实验室常用保存于病毒类标本的容器。采集好的蚊虫分类分组后，装入冻存管中（或者是螺口的塑料血清管中），用耐低温油性记号笔写上编号，并将标本管放人纱布袋中，纱布袋的封口线上用胶布缠上并记录采集的时间和地点，将纱布袋放人液氮罐或掩埋于干冰中。
B.2.5蚊虫标本的运输
标本运输的原则是：标本一定要放置在液氮或干冰中，在运输中保持冷链。对陆路运输送检的标本，尽可能采用液氮送检，即将标本连同装标本的液氮罐一并运送到目的实验室，并确保标本送到实验室时仍浸泡于液氮中；对于较远距离运输的标本，建议采用航空托运的方式送检。由于民航部门不允许液氮随机托运，只能采取干冰送检，方法如下：送检人员在登机的当天将标本从液氮（或一70℃超低温冰箱）中取出，立即装入含10kg干冰的泡沫箱中打包，送机场随机托运，到达目的地后随即将标本送到实验室，并确保标本送到实验室时干冰仍覆盖标本。SN/T2300-2009
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法
SN/T2300—2009
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址www.spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16印张0.75字数13千字2009年10月第一版2009年10月第一次印刷印数1—2000
书号：155066·2-19914定价16.00元
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国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法
Detection of mosquito-borne chikungunya virus at frontier port2009-07-07发布
中华人民共和国國
数码防伤
国家质量监督检验检疫总局
2010-01-16实施
本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局。SN/T.2300—2009
本标准主要起草人：黄吉城、郑夔、洪烨、李小波、幸芦琴、师永霞、钟玉清、相大鹏、郭波旋、胡龙飞、陈永红。
本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1范围
国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法
SN/T2300—2009
本标准规定了国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法，包括标本采集、处理、检测程序、结果判定及报告。
本标准适用于国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的实验室检验，2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。比是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不通用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是未注日期的引用件，其最新版本适用于本标准。GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本标推
基孔肯雅病毒chikungunyavirus基孔肯雅病毒是单股RNA病毒，属于披膜病毒科甲病毒属。病毒颗粒呈球形，平均直径42nm，相对分子质量为4.3×108，沉降系数为469。该病毒感染人可引起基乳肯雅热，主要临床表现为发热、关节疼痛、皮疹和轻度出血等。本病潜伏期3d3.2
12d，伊救是其主要传播媒介。
实时荧光RT-PCRreal-timefluprescenteRT-PCR实时荧光 RT-PCR方法是在常规RT-PCR的础上，姗人条特异性的荧光探针。该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个报皆基团和一个淬火荧荣光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，利用Vag酶的5’3'外切酶活性将探纤酶切降解，使报告荧光基团和灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光储号。每个反应内的荧光信号达到设定的阐值时所经历的循环数，用Ct值（cyclethreshold）表示。4实验室生物安全要求
4.1基孔肯雅病毒培养和动物感染实验应在生物安全三级(BSL-3)实验室内进行。4.2未经培养的基孔肯雅病毒感染性材料的操作应在生物安全二级(BSL-2)实验室内进行。4.3基孔肯雅病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级(BSL-1)实验室内进行。4.4
基孔肯雅病毒感染性材料运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。其他要求按GB19489进行。
主要仪器设备
主要仪器设备如下：
荧光定量PCR仪；
SN/T2300—2009
二级生物安全柜；
CO2培养箱；
倒置显微镜；
高压灭菌器；
-70℃超低温冰箱（或液氮罐）；冷冻离心机（带密封的离心安全杯，最大离心力20000g)：玻璃研磨器；
涡旋器。
6·.主要试剂
6：1标本处理液：在新鲜配制的95mLMEM（最低必须培养基，配方见附录A）中加入56℃热灭活30min的胎牛血清2mL、1mL庆大霉素（5000μg/mL）、1mL两性霉素B(250μg/mL）和1mL青链霉素（青霉素G10000U/mL、链霉素r0000μg/mL），用7.5%碳酸氢钠溶液调至pH7.2。6.2Hank's液：配方见附录A。
6.3核酸提取试剂：用QIAampViralRNAKit，详见试剂盒说明书1），内含AVL、AW1、AW2和AVE等成分。
6.4Ag-Path-IDTMOnestepRT-PCRKit，美国Ambion公司产品1）6.5 DEPC水。
6.6实时荧光RT-PCR检测的引物和探针：CHIK-FP5'-TTTAGCCGTAATGAGCRTCGG-3”CHIK-RP5'-CCGTGTTCGGGATCACTGTTA-3*CHIK-probe5'FAM-TGCCCACACTGTGA-BHQ1-3’（LNA探针，下划线斜黑体字母表示LNA修饰碱基）。
7i标本的采集与处理
7.1根据监测任务等实际工作需要采集所需数量的蚊子标本（参见附录B）。7.2将采集的蚊子直接放入一20℃冰箱30min以上冻死后，取出，分类编号，按30只一份，装入2mL螺口塑料血清管内，旋紧管盖，做好编号，立即放人液氮罐或干冰内（一70℃以下）运输或保存。7.3标本的处理：在冰上操作。从一70℃以下超低温冰箱中取出蚊标本，倒人研磨器中，加入Hank's液1mL吹洗，弃去液体后加入1mL标本处理液，反复研磨至组织碎片基本消失，随后将研磨液吸入1.5mLeppendorf离心管，平衡后置预冷4℃的离心机上，12000r/min离心10min。取上清液提取核酸进行实时荧光RT-PCR检测，或接种组织细胞进行病毒分离。剩余的蚊标本研磨液需保存在一70℃以下超低温冰箱以备复查
8！检验程序
8.1C6/36细胞培养分离病毒
8.:1.1在96孔平底组织培养板中，每孔加人50μL蚊媒标本研磨液，每份标本平行加2孔，预留2孔作为正常细胞对照。
8.:1.2每孔加人200μLC6/36细胞（1×106个/mL）。11）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则-
可使用这些等效产品。
SN/T2300—2009
8.1.3加盖，置CO2培养箱（33℃，5%二氧化碳，湿度80%）中培养7d，每天于倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)情况并作好记录。
8.1.4不管细胞是否出现CPE，每份标本均连续传3代，3代后出现CPE的孔可将上清液吸出接种细胞瓶（管）进行增殖，或置一70℃超低冰箱保存，待作进一步鉴定，8.1.5病毒培养的结果观察：基孔肯雅病毒在C6/36细胞上的典型细胞病变(CPE)为细胞肿胀、破碎、团聚、融合、脱落。
8.1.6病变的细胞按8.2和8.3进行病毒检测。8.2病毒核酸提取
8.2.1取蚊标本研磨液或细胞培养上清140μL加人560μL裂解液（AVL），在旋涡混合器上振荡15s混匀，室温静置10min。
8.2.2加人560μL无水乙醇终止反应，在旋涡混合器上振荡15s混匀。8.2.3裂解后的液体分两次移入管柱，每次8000r/min离心1min，此时病毒RNA会吸附在管柱底部的膜上。
8.2.4加500uL洗液（AW1)至管柱上，8000r/min离心1min，弃去AW1。8.2.5加500uL洗液（AW2)至管柱上，14000r/min离心3min，弃去AW2。进一步离心14000r/min1min以彻底去除残留在膜上乙醇。.8.2.6加人60μL洗脱液（AVE），室温静置1min。8.2.7将管柱置于1.5mL离心管上，4℃离心8000r/min1min，得到的RNA即可进行实时荧光RT-PCR检测。
8.3实时荧光RT-PCR检测方法
8.3.1反应液的准备
设置20μL反应体系，每个待检标本反应液的组成为：无RNA酶的灭菌双蒸水
2XRT-PCR Buffer
20μM CHIK-FP\
20 μM CHIK-RP
5 μM CHIK-Probe
10 μL
25XRT-PCREnzymeMix0.8 μL
模板RNA
8.3.2扩增程序
在全自动荧光定量仪AppliedBiosystems7500FastReal-TimePCRSystems2）上检测时，扩增程序为：50℃10min，95℃10min，95℃10s→62℃30s45（检测荧光信号）循环。若仪器为Roche?LightCyclerRealTimePCR扩增仪2），则扩增程序为：50℃10min，95℃10min，95℃5s→62℃20s45循环。由于不同的荧光定量PCR仪性能有差异，必要时扩增程序可做适当调整。9结果判定与报告
9.1反应结果应同时符合阴性对照无扩增曲线而阳性对照Ct<35并有明显扩增曲线2个条件。否则，试验结果无效。
9.2阴性结果：样品无Ct值或Ct>45，且无明显扩增曲线，报告为基孔肯雅病毒核酸荧光RT-PCR检2）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
SN/T.2300—2009
测阴性。
9.3阳性结果：样品Ct值≤40，并有明显扩增曲线，报告为基孔肯雅病毒核酸荧光RT-PCR检测阳性。
9.4可疑结果：样品Ct值在40～45之间的标本应重做，若重做结果仍然有明显扩增曲线，则该标本判断为基孔肯雅病毒核酸荧光RT-PCR检测阳性，否则为阴性A.1MEM配方
MEM配方见表A.1。
氯化钙
氮化钾
无水硫酸镁
氯化钠
无水磷酸二氢钠
L-精氨酸盐酸盐
L-胱氨酸盐酸盐
L-谷氮酰胺
L-组氨酸盐酸盐
L-异亮氨酸
L-亮氨酸
L-赖氨酸盐酸盐
L-蛋氨酸
L-苯丙氨酸
A.2Hank's液配方
附录A
（资料性附录）
MEM和Hank's液配方
表A.1MEM配方
用（mg1）
L苏氨酸
L.色氨酸
L-丝氨酸
+葡萄糖
D泛酸钙
化胆践
-肌醇
烟能胺
盐酸吡哆
核费察
盐酸硫胺
碳酸氢钠0.35g，
磷酸二氢钾0.06g，氯化钠
氯化钾0.
.0g，
(Na2HPO4·H2O)0.06g,加水到1 000ml..HankSN/T2300—2009
用量/（mg/L）
g，葡萄糖1.0g，磷酸氢二钠
液可以高压灭菌
着，分装于4℃下保存。
SN/T2300—2009
B.1准备
B.1.1幼虫捕捞器材
附录B
（资料性附录）
蚊虫标本的采集、运输和保存
水勺和水网，宽口长、短吸管，青霉素瓶或其他小瓶，幼虫饲养笼，B.1.2成蚊采集器材
诱蚊帐，诱蚊灯，电动吸蚊器，捕蚊磁场，捕虫网、集蚊袋、手电筒等。B.1.3其他器材
液氮罐（含液氮）或干冰、螺口血清管、纱布、工作记录表、小标签纸、记录笔、油性记号笔（耐低温)等。
B.2.采集方法
蚊虫滋生地选择：
白纹伊蚊白天在人房、竹林活动：致倦库蚊在人房；中华按蚊、三带喙库蚊在既舍；小容器收集的蚊幼多为伊蚊、库蚊；大型静水（稻田、菱白田、池沼、低洼积水等收集的是中华按蚊、窄卵按蚊、三带喙库蚊；污水沟、坑、清水粪缸收集的多为淡色库蚊、致倦库蚊。B.2.2蚊虫采集
B.2.2.1电动吸蚊器人工诱捕法
选择各种蚊虫栖息的场所，如库蚊以人房、牛棚、猪舍作为捕捉点于日落后1h～1.5h开始捕捉，伊蚊以竹林、香蕉园等半家栖环境于上午和近黄昏时段用电动吸蚊器捕捉。B.2.2.2.捕蚊磁场自动诱捕法
选择各种蚊虫栖息的场所，放置一台捕蚊磁场，以液化石油气为气源和动力源，按说明连续开启捕蚊磁场自动诱捕蚊虫，诱捕2h～4h或一夜。B.2.2.3人帐法
在蚊虫滋生地附近，挂一大型蚊帐，将帐项支平，四角拉开，下缘离地面30cm～40cm，人在帐内诱蚊人帐，以吸蚊器连续捕蚊。
B.2.2.4灯诱法
将诱蚊灯悬挂于蚊虫滋生地、猪场、牛棚、居民点周围的空地上，离地1m～1.5m，傍晚开启电源进行自动诱捕，诱捕2h～4h或一夜。B.2.2.5网捕法
操作时，采集者手持网柄，伸直胳膊作“co”形挥网，每次以55次/min的频率采集。B.2.2.6勺捞法
选择各种蚊幼滋生的场所（池塘、溪流、沟渠、水潭、稻田等）用金属制的标准捞勺（容积约400mL或市售的小奶锅安一柄即成）或水网（粗铁线缝上纱布制成），于幼虫滋生的水体，在离岸1m以内，随机采集水样，如有各龄幼虫或蛹，用粗口吸管吸入广口瓶内。B.2.3蚊虫标本的现场处理
将收集于集蚊袋中的蚊子连同集蚊袋一起直接放人一20℃冰箱冰30min以上冻死后，取出，分类编号，按30.只一份，装入2mL螺口血清管内，旋紧管盖，做好编号，置液氮（或一70℃超低温冰箱或掩埋于干冰)中冻存待检。每支标本管的编号应与记录表格一一对应，原始记录表格要详细填写。6
B.2.4蚊虫标本的保存
SN/T 2300—2009
要保持蚊体内虫媒病毒的活性，分装好的蚊标本需保存在一70℃以下，直到进行标本检测。液氮的温度为一196℃，因此最好能将标本保存于液氮中；干冰的温度为一82℃，也可将标本掩埋于干冰中保存，但用干冰保存时不可直接将标本放置于干冰上，因为干冰上面的温度仅达一30℃左右，不足以长时间保持病毒的活性；一70℃以下超低温冰箱是实验室常用保存于病毒类标本的容器。采集好的蚊虫分类分组后，装入冻存管中（或者是螺口的塑料血清管中），用耐低温油性记号笔写上编号，并将标本管放人纱布袋中，纱布袋的封口线上用胶布缠上并记录采集的时间和地点，将纱布袋放人液氮罐或掩埋于干冰中。
B.2.5蚊虫标本的运输
标本运输的原则是：标本一定要放置在液氮或干冰中，在运输中保持冷链。对陆路运输送检的标本，尽可能采用液氮送检，即将标本连同装标本的液氮罐一并运送到目的实验室，并确保标本送到实验室时仍浸泡于液氮中；对于较远距离运输的标本，建议采用航空托运的方式送检。由于民航部门不允许液氮随机托运，只能采取干冰送检，方法如下：送检人员在登机的当天将标本从液氮（或一70℃超低温冰箱）中取出，立即装入含10kg干冰的泡沫箱中打包，送机场随机托运，到达目的地后随即将标本送到实验室，并确保标本送到实验室时干冰仍覆盖标本。SN/T2300-2009
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法
SN/T2300—2009
中国标准出版社出版
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开本880×12301/16印张0.75字数13千字2009年10月第一版2009年10月第一次印刷印数1—2000
书号：155066·2-19914定价16.00元
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