中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2327-—2009
进出口动物源性食品中角黄素
虾青素的检测方法Www.bzxZ.net
Determination of canthaxanthin and astaxanthinin foods of animal origin food for import and export2009-07-07发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2010-01-16实施
本标准附录A、附录B和附录C均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局。本标准主要起草人：余孔捷、钱疆、刘正才、杨方、黄杰、李耀平、李捷。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准SN/T2327—2009
1范围
进出口动物源性食品中角黄素、虾青素的检测方法
SN/T2327—2009
本标准规定了进出口动物源性食品中角黄素、虾青素的高效液相色谱检测与液相色谱-质谱/质谱确证法。
本标准适用于黄鱼、鳗鱼、鸡肉、鸡蛋、鸭肝、猪肾和牛奶中角黄素、虾青素的测定与确证。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3方法提要
试样用乙睛提取，正已烷脱脂、浓缩后，高效液相色谱仪进行检测，外标法定量。如有必要可用液相色谱-质谱/质谱法确证。
试剂和材料
所有试剂除特殊注明外，均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1乙睛：色谱纯。
4.2正已烷：色谱纯。
4.3正丙醇。
4.4甲酸。
4.52,6-二叔丁基对甲酚(BHT)：化学纯。4.6无水硫酸钠：650℃灼烧4h，贮于干燥器内，冷却后备用。4.7乙酸铵。
4.8乙睛提取剂：0.25gBHT溶解于500mL乙腈。4.9BHT-乙睛溶液：5gBHT溶解于500mL乙睛。4.10乙酸铵溶液（5mmol/L，含0.2%甲酸）：称取0.38g乙酸铵，用水溶解稀释后，加2.0mL甲酸，加水至1.0L。
4.11角黄素标准品：canthaxanthin，CAS：514-78-3，纯度大于等于90%，于4℃避光贮存。4.12虾青素标准品：astaxanthinCAS：472-61-7，纯度大于等于90%，于18℃避光贮存。4.13标准储备液：分别准确称取适量（相当于5.00mg纯品，精确至0.01mg）角黄素、虾青素标准品，分别加人BHT-乙睛溶液（4.9)溶解，定容于200mL棕色容量瓶，配制成浓度为25.0μg/mL的标准储备液。充氮气置一18℃避光保存，可使用两周。4.14混合标准工作液：分别准确移取摇匀的角黄素、虾青素标准储备液，混合，用乙腈准确稀释成适宜浓度，即配即用。
SN/T2327—2009
仪器和设备
高效液相色谱仪：配二极管阵列(DAD)或紫外-可见(UV-Vis)检测器。5.2
液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾(ESI)离子源。分析天平感量0.01mg，0.01g。
旋涡混合器。
超声提取器。
离心机：5000r/min。
旋转蒸发器。
微孔滤膜：0.22μm，有机系
·试样制备和保存
黄鱼、鳗鱼、鸡肉、鸭肝、猪肾从所取全部样品中取出有代表性样品可食部分纳500g，用高速组织捣碎机充分捣碎、混匀。6.2．鸡蛋
从所取全部样品中取出有代表性样品可食部分约5机充分捣碎、混匀。
6.13，牛奶
g（生蛋应煮熟冷却后剥壳），用高速组织捣碎从所取全部样品中取出有代表样品约500g，充分混匀，置于合适洁净容器。制样操作过程中应防止样品受到污染或发生角黄素、虾青素含量的变化，制样温度不应高于30℃，制样后应立即测定。需存放的试样应密封于洁净容器、避光、于一18℃以下冷冻存放。测定步骤
提取与净化
称取试样约5g（精确至0.01）于50ml比离心管中，加人30冲L乙腩提取剂（4.8)及10g无水硫酸min，再以300r/min离心5min。将上清液钠（4.6)后，涡旋混合1min，在35以下永浴超声提取10
移人预置有.20mL正已烷的125mlL分液漏斗中中，振摇ol5min层，静置分层；收集下层乙腈相，正已烷相留在分液漏斗，待本试样后续脱脂重复使按上述步骤对离心管中的残留物每次用20mL乙睛提取剂再重复提取两次，所得提取液用上述正已烷相依次脱脂。合并三次脱脂后所收集的乙腈相，加人5mL正丙醇，于40℃以下旋转蒸发浓缩至近于，用乙睛溶解并定容至5.0mL，0.20um滤膜过滤，滤液待测测定操作应避强光、连续进行。7.2·高效液相色谱法测定
7.2.1色谱条件
色谱柱：WatersSymmetryCis，4.6mm（内径）X250mm，5μm，或相当者；a)
柱温：35℃；
流动相：乙睛-水（95+5，体积比）；流速：1.0mL/min；
检测波长：471nm；
进样量：50μL。
7.2.2色谱测定
根据试样中被测物的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和待测样液中角黄素、虾青素的响应值应在仪器线性响应范围内。标推工作液与待测样液等体积进样。在上2
SN/T2327—2009
述色谱条件下，虾青素反式、顺式异构体保留时间分别约为8.4min、10.6min，角黄素反式、顺式异构体的保留时间分别约为17.5min、19.0min，根据峰面积外标法定量。标准品色谱图参见附录A图A.1。7.3.确证
7.3.1液相色谱-质谱/质谱条件
色谱柱：AcquityUPLCBEHC1g柱，2.1（内径）mmX55mm，1.7μm，或相当者；b)
柱温：30℃；
进样量：10μL；
流速：0.3mL/min；
流动相和梯度洗脱：流动相和梯度洗脱程序见表1；离子源：电喷雾源ESI，正离模式；扫描方式：多反应监测(MRM)，
其他参考质谱条件参见附录B中表B.1。表1流动相和梯度洗脱程序
时间/min
乙腊/%
7.3.2液相色谱-质谱/质谱确证
乙酸铵溶液(4.10)/%
将7.:1中所得样液（必要时用液相色谱纯乙睛稀释至适当浓度）和混合标准工作液用LC-MS/MS检测。如果样液和混合标准工作液两者检出的色谱嵊保留时间-致，并且在扣除背景后的样品谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下得到的标准溶液谱图榈比，其相对偏差不超过表2中规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。确黄素、青案标准品多反应监测（MRM)离子色谱图参见附录C的图C.1。
相对离子丰度/%
允许的相对偏差/%
7.4空白实验
定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差>50
除不称取试样外，按上述测定步骤进行8结果计算
采用外标法定量，按式(1)计算样品中角黄素或虾青素的含量：X:
式中：
>10~20
一样品中角黄素或虾青素的含量（顺、反式异构体总量），单位为毫克每千克（mg/kg）；一测定液中角黄素或虾青素的峰面积；一标准工作液中角黄素或虾青素的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V定容体积，单位为毫升（mL）;一标准工作液中角黄素或虾青素的峰面积；A.
最终样液所代表的样品质量，单位为克(g）。SN/T 2327—2009
测定低限与回收率
测定低限
本方法中高效液相色谱法对角黄素、虾青素的测定低限均为：0!1mg/kg。9.2回收率
高效液相色谱法测定角黄素、虾青素的回收率数据参见表3。表3回收率数据
添加浓度/（mg/kg）
角黄素回收率/%
81.8~107.5
88.6~105.0
89.7~104.1
80.6～104.2
82.2~93.8
83.2~93.8
87.1~99.8
80.2~108.1
86.4~107.3
94.0108.7
95.9~108.0
88.7~99.9
81.5～97.0
84.7~93.6
81.3~89.9
87.5~109.6
91.3~109.8
90.3~104.0
95.7~105.6
84.9~100.J5
79.7~92.7
81.6~92.2
80.1~97.|6
83.3~109!0
83.9~100l4
89.8~108.0
89.6~102.3
虾青索回收率/%
82.0~107.9
83.0~105.0
92.5～97.5
85.4~106.8
80.1～90.9
81.1~89.8
80.8～99.8
80.9～97.8
81.1~104.0
80.1～92.9
80.3～89.8
86.8~104. 9
82.0~94.4
84.3~93.6
80.8~92.0
90.3~101.0
88.7~101.0
95.1~101.7
93.0~102.0
80.4～93.5
81.3~92.1
80.2～85.3
88.6～95.0
80.4～86.4
80.7~88.1
79.9~97.1
82.8~90.6
一虾青素反式体：
虾青素顺式体；
3—角黄素反式体；
角黄素顺式体。
附录A
（资料性附录）
标准品高效液相色谱图
标准品的高效液相色谱图
SN/T 2327—2009
SN/T2327—2009
参考质谱条件：
电离方式（Polarity）：ESI+；电离电压(Capillary)：3.0kV；附录·B
（资料性附录）
参考质谱条件1)
离子源温度（SourceTemperature）：115℃；脱溶剂气温度（DesolvationTemperature).34o℃锥孔反吹气流量(ConelGas Flow)：45 i./h(氮气）；脱溶剂气流量(Desolvalion GasFlow)：750 L/h(氮气);碰撞室压力(Gas Cellirani_Pressure)i4.96×103mbard碰撞气为氩气）)；其他质谱参数见表B.1。
表 B,主要参考质谱参数
化合物
角黄素
虾青素
母离子（m/z）
子离子(m/2)
锥孔电压/V
碰撞能量/eV
驻留时间/s
所列参考质谱条件是在QuattroPremierXE型液质联用仪上完成的，对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。100F
1-虾青索反式体；
一虾青素顺式体；
一角黄素反式体；
角黄素顺式体。
(资料性附录）
标准品多反应监测(MRM)离子色谱图1.3
&)虾青素
b）虾青索
c）角黄
d）角黄素
MRMof4
SN/T2327—2009
597.36>378
MRMof4ChannelsES+
597.36>146.9
MRM of 4 Channels ES-
564.8>203.3
MRMof 4Channels ES+
564.8>133.4
5.00t/min
角黄素、虾青素标准品多反应监测(MRM)离子色谱图图c.1
SN/T2327—2009
Foreword
Annex A,annex B and annex C of this standard are informative annexes.This standard was proposed by and is under the charge of the Certification and Accreditation Admin-istration of thePeople's Republic of China.This standard was drafted by Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of the People's Re-public of China.
The main drafters of this standard are Yu Kongjie,Qian Jiang, Liu Zhengcai, Yang Fang,Huang Jie, LiYaoping,Li Jie.
This standard is a professional standard for entry-exit inspection and quarantine promulgated for thefirst'time.
SN/T 2327—2009
Determination of canthaxanthin and astaxanthinin foods of animal origin food for import and exportScope
This standard specifies the methods of determination of canthaxanthin and astaxanthin in animal ori-gin food by high performance liquid chromatography and themethods of confirmationby LC-MS/MS.This standard is applicable to the determination and confirmation of canthaxanthin and astaxanthin inlarge yellow croaker muscle,eel muscle,chicken muscle,chicken egg,duck liver,pig kidney and milk2Normative references
The following normative documents contain provisions which,through reference in this text,consti-tute provisions of this standard. For dated references,subsequent amendments to, or revisions of,any of thesepublications do not apply.However,parties to agreements based in this National Stand-ard are encouraged to investigate the possibility of applying the most recent editions of the norma-tivedocuments indicatedbelow.For undated references, the latest edition of the normative document referred to applies.GB/T6682Waterforanalytical laboratoryuse-Specificationandtestmethods3 Principle
The canthaxanthin and astaxanthin in the test sample are extracted with acetonitrile. After being de-fatted by hexane, the acetonitrile phase is concentrated. Finally, the canthaxanthin and astaxanthin aredetermined by high performance liquid chromatography,quantified by externa! standard method. Ifnecessary,the detectable sample maybe confirmed by HPLC-MS/MS method.4Reagents and materials
Unless specified, all reagents should be of AR; “water\ is the first grade water prescribed by.GB/T6682.